لقد طورنا طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة. يمكن لهذه الطريقة توفير عوامل خارجية المنشأ لوسائط الثقافة ويمكنها فحص إعادة تنشيط الأرومة العصبية. يمكن تطوير علاجات أفضل بالخلايا الجذعية من خلال فهم أفضل لكيفية استجابة الخلايا الجذعية الهادئة للإشارات الخارجية ودخولها دورة الخلية.
ستوضح الإجراء سوزان دويل ، عالمة أبحاث من مختبري. للبدء بعناية اختيار ما يقرب من 20 إلى 25 يرقات حديثة الفقس من صفيحة أجار العنب تحت المجهر تشريح. املأ طبق بتري بحوالي ملليلتر من PBS وغمر طرف الأداة الذي يحتوي على يرقات في PBS لمدة دقيقتين.
بعد دقيقتين ، قم بقلب الطبق بزاوية لتجميع السائل في الأسفل ، وباستخدام فرشاة طلاء صغيرة ، قم بتنظيف اليرقات من السائل إلى أسفل طبق بتري. جمع جميع اليرقات على فرشاة الطلاء وشطف اليرقات لفترة وجيزة في 70٪ الإيثانول قبل نقلها مرة أخرى إلى طبق بتري الذي يحتوي على PBS. رش منطقة العمل وأدوات التشريح والملقط وطبقي ساعة زجاجيين مع 70٪ من الإيثانول واتركها تجف على المقعد.
اصنع وسيط شنايدر الثقافي المكمل ، أو SSM ، وضعه على الجليد. ماصة واحدة ملليلتر من الوسط في كل طبق ساعة زجاجي. باستخدام ماصة صغيرة ذات طرف معقم ، انقل اليرقات الطازجة من لوحة PBS إلى SSM في أول طبق ساعة زجاجي.
تشريح الأدمغة من اليرقات الموضوعة في طبق الساعة الزجاجي الثاني باستخدام SSM باستخدام ملقط تحت مجهر تشريح وضبط التكبير حسب الحاجة. استخدم ملقطا واحدا للاستيلاء على خطافات الفم ، وبالآخر ، أمسك الجسم بلطف في منتصف الطريق لأسفل واسحبه في الاتجاه المعاكس لتقسيم اليرقة إلى قطعتين. بعد تشريح 15 إلى 20 دماغا ، أضف ملليلتر واحد من SSM إلى بئر واحد من صينية زراعة معقمة من 24 بئرا.
باستخدام ماصة دقيقة وطرف معقم ، انقل الأدمغة التي تم تشريحها حديثا إلى SSM ، تليها حضانة الوسائط مع الأدمغة لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية. ماصة 10 ميكرولترات من مخزون 10 ملليمولار من 5-ethynyl-2'deoxyuridine ، أو EDU ، مع 990 ميكرولتر من SSM في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، امزج ، ثم ماصة ملليلتر واحد من EDU SSM في بئر واحد من صينية الثقافة المعقمة المكونة من 12 بئرا. انقل الأدمغة باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف معقم من البئر الذي يحتوي على SSM إلى البئر الجديد الذي يحتوي على محلول EDU SSM واحتضنها لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.
بعد ذلك ، انقل الأدمغة التي تحمل علامة EDU إلى بئر آخر في نفس صينية الثقافة التي تحتوي على ملليلتر واحد من المثبت والسماح بتثبيت الأدمغة لمدة 20 دقيقة. بعد التثبيت ، انقل الأدمغة بسرعة إلى آبار صينية صغيرة ذات 72 بئرا باستخدام ماصة دقيقة. شطف الأدمغة ثلاث مرات في 10 ميكرولترات من PBT وتكرار ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق لكل منها ، وضمان تغطية الأدمغة دائما ببعض السوائل.
ماصة 10 ميكرولتر من محلول الحجب على الأدمغة. قم بتغطية الدرج وختمه بشريط من البارافيلم حول الحافة. يوضح الشكل خلايا الخلايا العصبية الكبيرة الحجم الإيجابية EDO والميتة الإيجابية بعد 24 ساعة من الزراعة في SSM مع الأنسولين والتلطيخ.
بعد 24 ساعة في وسائط شنايدر المكملة بدون أنسولين ، لم يكن لدى أدمغة أوريغون R البرية التي تم فقسها حديثا خلايا انفجار عصبي كبيرة الحجم إيجابية EDO وإيجابية ميتة ، بخلاف خلايا الأرومة العصبية المكونة من أربعة فطر في الجسم وخلية واحدة من الخلايا العصبية البطنية الجانبية. أثناء التصوير البؤري ، لوحظت أحيانا بعض نصفي الكرة المخية مع تلف ، مثل الثقوب الصغيرة إلى الكبيرة الحجم في أنسجة المخ المزروعة. لم يتم استخدام أي أدمغة بها ثقوب للتحليل.
تشريح الأنسجة بعناية وماصة بلطف لتجنب أي تلف في الأنسجة. حاول أيضا أن تكون معقما قدر الإمكان ولا تلوث ثقافاتك. نظرا لأنه يمكن التلاعب بالوسائط الثقافية بسهولة عن طريق إضافة عوامل مختلفة ، يمكن استخدام هذه التقنية لمعالجة الفرضيات المستقبلية المتعلقة بالإشارات الخارجية ودخول وخروج السكون العصبي.
