نود أن نشكر جميع أعضاء مختبرنا لمناقشاتهم، وتقديم المشورة المفيدة والتعليقات على المخطوطة. ونحن أيضا نود أن نشكر بشكل خاص مارتا كوخ وحسن باسم لاقتراح ممتاز أن ننتظر حتى 1.5 ساعة APF قبل تشريح أدمغة للزراعة في إعادة عرض التجارب. كما نشكر مركز التصوير NHGRI لاستخدام مجهر متحد البؤر بهم. وأيد هذا العمل من قبل برنامج العلوم العصبية الأساسية لبرنامج بحوث ضمن الجدران NINDS، المعاهد الوطنية للصحة (Z01 NS003106).

أ. إعداد وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد وسائل الإعلام كاملة بواسطة فلتر تعقيم شنايدر ذبابة الفاكهة وسائل الإعلام تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عقار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي إعداد وسائل الاعلام في كل مرة جديدة. بدلا من ذلك، يمكن إذابة 1 قسامة جديدة من قبل وسائل الاعلام المجمدة قبل كل استعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل زراعة، إضافة 10 ميكروغرام / مل الانسولين و 2 ميكروغرام / مل إكديسون إلى وسائل الإعلام. وأعدت المخدرات كما أسهم المركز والمجمدة في aliquots الصغيرة. وكانت aliquots إذابة ليس معاد تجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي الحفاظ على جميع العاملين في حلول 25 درجة مئوية. </li></ol> زراعة أدمغة اليرقات 1. اختيار وتشريح أدمغة اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام لمدة 12 ملم Millicell إدراج ثقافة الخلية. سيتم وضع العقول في تشريح هذه الملاحق لتسهيل المناعية سهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية صغيرة من وسائل الاعلام استعدادا لتشريح زجاج ووتش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوالغناء ملعقة صغيرة، والتقاط تجول يرقات العمر الثالث ووضعها في كوب ووتش. (ونحن نفترض أن ثقافة المجراة سابقا طريقة وتنطبق كذلك على يرقات العمر الأول أو الثاني، لكننا لم نجرب هذا.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نهاية الخلفي لليرقة مع زوج من ملقط، فتح بعناية حتى نهاية الأمامي مع زوج الثانية من # 5 ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح بسرعة خارج الدماغ، والحفاظ على حبل العصب بطني سليمة. </li></ol> 2. زراعة المجراة سابقا من الأمخاخ اليرقات مشرح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصائح باستخدام ماصة ما قبل الرطب، ونقل الدماغ بعناية في إدراج ثقافة الخلية، معبأة سلفا مع وسائل الاعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدمغة نقل، في وسائل الإعلام، إلى حاضنة عند 25 درجة مئوية حتى وقت المطلوب نقطة يتم التوصل إليه. هذا الأسلوب يعمل بكفاءة لمدة تصل إلى 48 ساعة في الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحل محل وسائل الإعلام في 8 ساعات. أبعد من ذلك، استبدال نصف وسائل الإعلام كل ساعة 5-6. </li></ol> 3. الدوائية من التلاعباليرقات الأمخاخ ويمكن استخدام هذه الطريقة في زراعة المجراة سابقا على التعاطي مع التفاعلات الدوائية الجينية أثبتت سابقا في مختبرنا 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 roscovitine ميكرومتر و 100 ميكرون olomoucine إلى وسائل الإعلام المعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عقل تشريح لهذه الوسائط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة العقول عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحل محل وسائل الإعلام في 8 ساعات. أبعد من ذلك، استبدال نصف وسائل الإعلام (مع المخدرات) كل ساعة 5-6. </li></ol> زراعة أدمغة العذارى 1. اختيار من شرانق لتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة الشرانق البيضاء على قارورة / قنينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار فقط الشرانق التي هي بيضاء تماما. لا ينبغي أن الشرانق مع أي نوع من التلون إدراجها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه المرحلة هي 0 ساعات بعد تشكيل Puparium (APF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهذه الشرانق تكون جاهزة للتشريح 1.5 ساعة بعد وضع العلامات. هذه خطوة حاسمة لضمان تقليم التنموية يحدث في الجسم الحي السابقين </eم&gt; ثقافة. </li></ol> 2. تشريح من الشرانق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام لمدة 12 ملم Millicell إدراج ثقافة الخلية. (سيتم وضع العقول في تشريح هذه الملاحق لتسهيل المناعية من السهل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم التوصل في الوقت المطلوب نقطة، إضافة كمية صغيرة من وسائل الاعلام استعدادا لتشريح زجاج ووتش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام صغيرة، ملعقة الرطب، والتقاط الشرانق ملحوظ من قبل لتشريح ووضعها في كوب ووتش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نهاية الخلفي من الشرانق مع زوج من ملقط، فتح بعناية نهاية الأمامي من حالة خادرة مع زوج الثانية من # 5 ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح بسرعة خارج الدماغ، والحفاظ على حبل العصب بطني سليمة والمرفقة. </li></ol> 3. التثقيف المجراة سابقا من الأمخاخ العذارى مشرح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغ بعناية في إدراج ثقافة الخلية، معبأة سلفا مع وسائل الاعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدمغة نقل، في وسائل الإعلام، إلى حاضنة عند 25 درجة مئوية حتى ف الوقت المطلوبتم التوصل oint. استخدمنا هذه الطريقة لمدة تصل إلى 10 ساعة في ثقافة للتجربة معروضة، ولكن يمكن تمديدها لفترات أطول من المراقبة والعلاج، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقت أطول من نقاط APF 8 ساعات، تحل محل وسائل الإعلام كل ساعة 5-6. </li></ol> من هذه الخطوة على والبروتوكول لم يتغير بالنسبة لكل من اليرقات والعذارى. ب. إصلاح الأمخاخ مشرح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم الوصول إلى المطلوب الوقت نقطة، وإزالة وسائل الاعلام وإضافة 500 ميكرولتر من الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X مع 0.5٪ تريتون X-100 (PBST) لمدة 30 دقيقة، ليحل محل مع الفورمالديهايد جديدة بعد 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من عدم السماح للعقل لتجف في حين يحل محل وسائل الاعلام مع مثبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الفورمالديهايد مع أربعة يغسل 10 دقيقة من برنامج تلفزيوني 1X مع 0.5٪ TritonX-100 (PBST). </li></ol> جيم تلطيخ الأمخاخ ثابت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم غسلها من الفورمالديهايد، منع العقول لمدة 1 ساعة في حل حجب PBS 1X مع 1٪ عاديمصل الماعز و 1٪ ألبومين المصل البقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الأولية تتكون في عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العقول بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، يغسل الأجسام المضادة الأولية مع أربعة يغسل 10 دقيقة من PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الثانوية تتكون في عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع أربع يغسل 10 دقيقة من PBST. </li></ol> D. تركيب المخ الثابتة وملون للفحص المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن العقول في وسائل الاعلام Vectashield المتصاعد لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب دماغ على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام Vectashield المتصاعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقائق الزجاج على جانبي العقول قبل تركيب الغطاء زلة. وهذا ما يمنع من أن يكون العقل المدبر وممرود، مع الحفاظ على عينة رقيقة بما يكفي لمسح جميع الطائرات التنسيق مع المجهر متحد البؤر. وكانت العقول الموجهة نحو متزايد على تسهيل عرض ملامح من الفائدة. عند الضرورة،وكانت الصور الدماغ بالتناوب مع برنامج Imaris بتقديم رأي الأمثل للتوثيق وقياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم تغطية زلات مع طلاء الأظافر واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن ينزلق بعيدا عن الضوء. </li></ol> هاء النتائج الممثل ويوضح الشكل 1 لجنة من الطور الثالث من العقول يرقات الذباب البرية من نوع (أ) و (B). الذباب التي تعبر عن مشتق المهيمنة سلبية من Cdk5 (Cdk5DN) (كونيل، كراولي وآخرون، 2000) على حد سواء صريحة أكتين-GFP (الخضراء) في الخلايا العصبية غاما ميغابايت. كما هو موضح سابقا (Trunova وآخرون، 2011)، وهناك منطقة في محاور عصبية من الخلايا العصبية القريبة غاما من النوع البري الذي فشل في جمع أكتين-GFP، مما يدل على خط النار في &quot;منطقة واضحة&quot; (A، قوس)، و fasciclin 2 بروتين (الحمراء) يتراكم في محاور عصبية تصل فقط الى الحدود بطني من هذه المنطقة (خط أفقي أبيض). خط منقط في لوحة الثالث من الشكل 1 (أ) يدل على موقف جماعة الإخوان المسلمين، وتسليط الضوء على قانونفي &quot;منطقة واضحة&quot; وحدودها بطني. الذباب في التعبير عن Cdk5DN، منطقة الأكتين واضح غائب (B) وFasciclin 2 (FasII) تفاعلية مناعية ظهريا ينتشر من خلال تلك المنطقة. (لاحظ أن عدد متغير من مشروع محاور عصبية FasII إيجابية أفقيا عبر ميغابايت، وهذه ليست ذات صلة النمط الظاهري). شريط الحجم يمثل 20 ميكرون. باستخدام طريقة لدينا من زراعة المجراة سابقا، نعامل البرية من نوع الذباب مع مزيج من roscovitine وolomoucine، مثبطات الدوائية من Cdk5 النشاط. ويبين الشكل 2 لجنة من الطور الثالث من العقول اليرقات من سيطرة (A) والمخدرات المعالجة (B ) البرية من نوع الذباب. تشبه الذباب تعبر عن السلبية السائدة Cdk5 بناء، العقل تعامل مع Cdk5 مثبطات لمدة 24 ساعة، وتبين فقدان المميزة لمنطقة الأكتين واضحة والتحول في حدود FasII (مربع بين قوسين). خطوط بيضاء إظهار موقف من حدود FasII من النوع البري. شريط الحجم يمثل 20 ميكرون. فيقوإعادة 3 يعرض سلسلة ممثل الهيئات فطر ذبابة الفاكهة 0-10 ساعات APF، وصفت مع غشاء استهداف mCD8-GFP (الخضراء). بين قوسين تشير إلى الكأس، وهذا هو، التوقعات شجيري من جماعة الإخوان المسلمين. قبل التحول، ويمكن للمرء أن يرى المحاور ميغابايت التعقيب ظهراني البطني في حزم سميكة، فضلا عن &quot;الضباب&quot; للإشارة فلوري الناشئة عن شجرة شجيري كثيف (قوس). وأشارت لوحة أظهرت أدمغة تشريح في ذلك الوقت. لاحظ التقليم من التشعبات في المنطقة المشار إليها بواسطة الأقواس، ان مثل هذه من قبل 6-8 ساعات ذهابه APF، في ضباب من إشارة شجيري (على الرغم من إشارة محواري تتأثر). تم تشريح أدمغة في لوحة (ب) في APF ساعات و 0، وذلك قبل ارتفاع إكديسون الداخلية (ترومان وRiddiford، 2002)، والمجراة سابقا مثقف كما هو محدد. هذه لا تظهر أي تشذيب التنموية من التشعبات، بل إشارة شجيري استمرت 10 ساعة في APF. للتحايل على هذا، يتم وضع علامة الشرانق في APF ساعات و 0، ولكن تشريح في 1.5 ساعة APF والمثقفين. جزءل C يظهر سلسلة ممثل لهذه الهيئات فطر ذبابة الفاكهة من APF 0-10 ساعات. كما هو الحال في العينات غير مثقف، إشارة شجيري غير قابل للكشف من قبل قوات الشرطة المسلحة ساعة 8. شريط الحجم يمثل 20 ميكرون.

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<html> التلاعب الوراثي المزمن في بنية الأنسجة وظيفة، بما في ذلك التحولات والتعبير عن الجينات المحورة، وعادة ما تنتج مجموعة من الآثار المباشرة وغير المباشرة في وقت متأخر العواقب التي يمكن أن يكون من الصعب جدا فصل. ويمكن استكمال الطرق الوراثية مع علم الصيدلة تسهيل استجوا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> نهائي تركيز </td></tr><tr><td> شنايدر ذبابة الفاكهة وسائل الإعلام </td><td> إينفيتروجن </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> الأبقار مصل الجنين (حرارة المعطل) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10082-147 </td><td> 10٪ </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتومايسين عقار </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140-122 </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> الانسولين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> إكديسون </td><td> سيغما الدريخ </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> سيغما الدريخ </td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> سيغما الدريخ </td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> طبيعي عنزة المصل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 50062Z </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> فيشر العلمية </td><td> M9501 </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> الفورمالديهايد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D4551 </td><td> 4٪ </td></tr><tr><td> تريتون-X 100 </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP151 </td><td> 0.5٪ </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت فوسفات المالحة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H1000 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> إدراجات Millicell خلية الثقافة </td><td> ميليبور </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish، 4 جيد </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> دومون # 5 الملقط </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر الشرائح </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> تغطية زجاج </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

ونحن تصف طريقة لاستزراع الأحياء السابقين من أدمغة ذبابة الفاكهة بأكملها. ويمكن استخدام هذا بمثابة الطباق إلى التلاعب الوراثي المزمن عن التحقيق في بيولوجيا الخلايا، وتطوير الهياكل المركزية في المخ من خلال السماح التدخلات الدوائية الحادة والتصوير الحي من العمليات الخلوية. وقد أظهرت كمثال على هذه التقنية، والعمل من قبل مختبر لدينا (1) التي مقصورة غير المعترف بها من قبل التحت خلوية تقع بين حجرات محواري وsomatodendritic من محاور عصبية في الدماغ المركزي ذبابة الفاكهة. وقد تبين في تطوير هذه المقصورة، ويشار إلى هذا الجزء محور عصبي الأولي (AIS) 2، وراثيا تعتمد على كيناز الخلايا العصبية الخاصة التي تعتمد على cyclin، Cdk5. نعرض هنا أن السابقين معاملة المجراة من عقل ذبابة الفاكهة البرية من نوع اليرقات مع roscovitine Cdk5 محددة مثبطات الدوائية وolomoucine 3 يسبب تغيرات حادة في منظمة الأكتين، وفي توطين Fasciclin بروتين على سطح الخلية 2، والتي تحاكي التغيرات ينظر في المسوخ التي تفتقر Cdk5 نشاط وراثيا. ويرد المثال الثاني من تقنية فيفو ثقافة السابقين لإعادة عرض للاتصالات من هيئة فطر الجنينية (MB) الخلايا العصبية جاما خلال التحول من يرقة إلى الكبار. هيئة فطر هي مركز التعلم والذاكرة الشمية في الذبابة 4، وهذه الخلايا العصبية غاما تقليم فروعها محواري وشجيري خلال تطوير العذراء ومن ثم إعادة تمديد فروع في timepoint في وقت لاحق لتأسيس نمط تعصيب الكبار 5. وقد تبين من تشذيب هذه الخلايا العصبية لجماعة الإخوان المسلمين أن يحدث عن طريق انحطاط المحلية لفروع neurite 6، من خلال الآلية التي يتم تشغيلها بواسطة إكديسون، وهو هرمون الستيرويد، ويتصرف بناء على مستقبلات إكديسون B1 7، والتي تعتمد على نشاط ubiquitin-proteasome نظام 6. يمكن أن أسلوبنا في زراعة المجراة سابقا باستخدام البريد لاستجواب مزيد من آلية إعادة عرض التنموية. وجدنا أن في الإعداد فيفو الثقافة السابق، الخلايا العصبية غاما من جماعة الإخوان المسلمين خصت عملية التقليم التنموية مع دورة الوقت مماثلة لتلك التي في الجسم الحي. كان من الضروري، مع ذلك، إلى الانتظار حتى 1.5 ساعة بعد تشكيل puparium قبل explanting النسيج حتى يتسنى للخلايا لارتكاب لا رجعة فيه إلى التحول؛ تشريح الحيوانات في بداية pupariation أدى إلى تحول ضئيلة أو معدومة في الثقافة. وهكذا، بعد إجراء التعديلات المناسبة، يمكن تطبيق ثقافة المجراة سابقا نهج لدراسة ديناميكية، فضلا عن الجوانب حالة مستقرة في علم الأحياء في الدماغ المركزي.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

وصف هذه المقالة على الطريقة التي يمكن لأحد أن يقلد<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تطوير<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; هيئة فطر في<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة.

السابقين التثقيف المجراة من الجامعة، تطوير الأمخاخ ذبابة الفاكهة

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

13.0K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. وصف هذه المقالة على الطريقة التي يمكن لأحد أن يقلد في الجسم الحي تطوير ذبابة الفاكهة هيئة فطر في خارج الحي نظام الثقافة.

Video: Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...