للبدء ، خذ خنثى C.Elegans المتزامنة في أنبوب طرد مركزي صغير. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 ، الذي يحتوي على Poloxamer 188 و Pluronic F127 واثنين ميكرولتر من كاشف مجموعة التلوين إلى حبيبات الدودة. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحماية الأصباغ من الضوء.
دع الخليط يدور عند 20 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم تدور الديدان في 500 غرام لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول التلوين دون إزعاج حبيبات الدودة.
اغسل الديدان بمحلول M9 ثلاث مرات وانقلها إلى صفيحة أجار NGM مصنفة تحتوي على العلاج المناسب. اغسل الديدان من الألواح في أنابيب طرد مركزي صغيرة جديدة مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت M9. بعد ذلك ، ثبت الديدان بنسبة 1٪ فورمالديهايد على الجليد لمدة 30 دقيقة.
واغسل الديدان بمليلتر واحد من المخزن المؤقت M9 ثلاث مرات لإزالة أي فورمالديهايد متبقي. بعد تكوير الديدان ، قم بنضح أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، مع الحفاظ على الحبيبات سليمة في 10 ميكرولتر من M9. بعد ذلك ، لتحضير 2.5٪ أغاروز ، قم بوزن 0.125 جرام من الأغاروز في أنبوب اختبار زجاج البورسليكات 10 ملليلتر. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت M9 وقم بإذابة الأغاروز عن طريق تسخين الأنبوب برفق باستخدام موقد بنسن.
انقل الأغاروز المذاب إلى حمام جاف عند 75 درجة مئوية. أضف 100 ميكرولتر من الأغاروز المذاب على زجاج غطاء مجهر لامع على سطح السفينة باستخدام طرف واحد ملليلتر. على الفور ، ضع شريحة أخرى بشكل عمودي على قطرة الأغاروز لتشكيل شكل متقاطع.
بعد دقيقتين ، افصل الشرائح برفق عن طريق دفع زجاج الغطاء العلوي مع ترك وسادة الأغاروز على شريحة الغطاء السفلي. انقل الديدان إلى وسادة الأغاروز باستخدام ماصة زجاجية باستور. استخدم فتيل مصنوع من مناديل مخبرية لإزالة السوائل الزائدة.
ثم قم بتغطية الديدان بغطاء أصغر وتطبيق طلاء الأظافر الشفاف على المحيط لمنع التبخر. ضع الشريحة في صندوق مظلم لحمايتها من الضوء. استخدم مجهرا متحد البؤر لتصوير الديدان في غضون 24 ساعة بأطوال موجية مناسبة باستخدام عدسة تكبير 60 مرة.
بعد ذلك ، افتح برنامج التصوير وانقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة الرمادية. من النافذة المنبثقة التي تظهر ، حدد الاستحواذ. Ti2 وسادة كاملة.
اقتناء ND وجداول البحث. تحت لوحة Ti2 الكاملة ، حدد 60 مرة واضبط مقبض التركيز الدقيق للمجهر لجلب الديدان إلى التركيز. ثم حدد قرص الغزل واختر خيار التجميع 16 بت.
لكل مرشح مضان ، اضبط وقت التعرض على 500 مللي ثانية و 20 مللي ثانية للمجال الساطع. بمجرد تعيين هذه المعلمات ، حدد تشغيل الآن وانتظر حتى يتم إنشاء صورة الإخراج كملف ND2.
