للبدء ، قم بتلقيح Limosilactobacillus reuteri DSM20016 من مخزون الجلسرين إلى ستة ملليلتر من مرق De Man أو Rogosa أو Sharpe أو MRS ، في أنبوب سعة 50 ملليلتر. احتضان الثقافة الهوائية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة. في اليوم التالي ، قم بتلقيح أربعة ملليلتر من الثقافة الليلية في 200 ملليلتر من مرق MRS.
اسمح للثقافة بالنمو هوائيا في حاضنة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.5 إلى 0.85. بعد ذلك ، صب الثقافة في أنابيب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وضعها على الجليد أثناء موازنة الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي الثقافة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا وتجاهل المادة الطافية.
قبل تعليق الحبيبات في 50 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج المبرد ، كرر الطرد المركزي مرتين. بعد الطرد المركزي الأخير ، أعد تعليق الحبيبات في 25 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج ، و 0.5 سكروز مولي ، و 10٪ جلسرين. قم بطرد مركزي تعليق الخلية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من الماء المقطر المزدوج ، و 0.5 سكروز مولار ، و 10٪ جلسرين على الجليد.
قم بتقسيم التعليق إلى أجزاء من 50 إلى 100 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا وقم بتخزين الأنابيب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها لاحقا. بعد ذلك ، من أجل التثقيب الكهربائي ، قم بإذابة حصة من الخلايا المختصة بالكهرباء على الجليد. امزج من خمسة إلى 10 ميكرولتر من البلازميد في القسمة المذابة مع تجنب السحب قدر الإمكان.
انقل الخليط إلى كوفيت ثقب كهربائي مبرد بمقدار ملليلتر واحد وإلكتروبورات عند 1.25 كيلو فولت و 400 أوم و 25 ميكروفاراد. بعد التثقيب الكهربائي ، أضف ملليلتر واحد من مرق MRS واخلطه عن طريق قلب الكوفيت مرة أو مرتين. ضع الكوفيت في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 2.5 إلى ثلاث ساعات للتعافي.
بعد ذلك ، قم بوضع التعليق بالكامل على ألواح مثقاب MRS متعددة مع الاختيار المناسب. ضع الألواح داخل حاوية محكمة الإغلاق مع شمعة صغيرة مضاءة في جو لاهوائي يولد الكيس. تنمو عند 37 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام أو حتى تظهر مستعمرات مرئية.
يعطي التثقيب الكهربائي ل L.reuteri مع mCherry2 التأسيسي الذي ينتج بلازميد pTRKH3 كفاءات تحويل من حوالي خمس إلى ثماني مستعمرات لكل 200 ميكرولتر مطلي بغض النظر عن حالة مثيلة البلازميد. أدى التحول باستخدام pNZ123 الذي لا يحمل أي بروتين مراسل تأسيسي خارجي إلى كفاءات تحويل تبلغ ثلاثة أضعاف 10 إلى أربعة CFU لكل ميكروغرام من الحمض النووي.
