للبدء ، قم بإذابة مسحوق النيل الأحمر في الأسيتون بتركيز ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر. احتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط الدوري. قم بترشيح المحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر مرة أو مرتين حسب كمية الراسب المتبقية في المحلول.
ثم قم بإعداد حل العمل عن طريق تخفيف محلول المخزون بنسبة واحد إلى 500 في DPBS. أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل إلى خلايا RPE الثابتة بارافورمالدهايد واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر يحمي من الضوء. بعد الحضانة ، اغسل العينات مرتين باستخدام DPBS ، ثم أضف 200 ميكرولتر من DPBS ، وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية.
بالنسبة لتلطيخ BODIPY ، قم بإعداد تركيز مخزون 3.8 مليمول عن طريق إذابة BODIPY في DMSO اللامائي. ثم قم بإعداد حل العمل عن طريق تخفيف محلول المخزون بنسبة واحد إلى 300 في DPBS. أضف 200 ميكرولتر من محلول عمل BODIPY إلى خلايا RPE المثبتة بارافورمالدهايد واحتضانها طوال الليل على الروك في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS وأضف 200 ميكرولتر من DPBS قبل تخزينها عند أربع درجات مئوية. بالنسبة للتلطيخ المناعي APOE ، قم بإعداد محلول عازل من خلال الجمع بين DPBS مع 1٪ BSA و 0.5٪ Tween 20 و 0.5٪ Triton X-100. قم بحظر وتخلل خلايا RPE المثبتة بارافورمالدهايد في 200 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة ، أضف الجسم المضاد الأولي APPLE المخفف من واحد إلى 100 في المحلول العازل واحتضانه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، اغسل العينات مرتين باستخدام DPBS. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي المخفف من واحد إلى 1000 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS وأضف 200 ميكرولتر من DPBS قبل تخزينها عند أربع درجات مئوية.
