نشكر مركز الأنسجة في المعهد الوطني للعيون (NEI) على استخدام نظام زايس متحد البؤر. تم دعم هذا العمل من قبل أموال NEI IRP (رقم المنحة ZIA EY000533-04).

نمذجة وتحليل تنكس الشبكية

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

لا إفصاحات.

يوفر هذا البروتوكول طريقة لتسمية وتصوير وقياس رواسب الدهون بكفاءة في نماذج الأمراض أحادية المنشأ ومتعددة الجينات في المختبر لأمراض العين التنكسية. يمكن تطبيق البرنامج القائم على الذكاء الاصطناعي ، LipidUNet ، على ثلاث علامات دهنية شائعة ، APOE و Nile Red و BODIPY ، ويوفر طريقة سريعة وتلقائية للتحليل تسمح بأن يكون القياس الكمي قياسيا وغير متحيز.
القيد الرئيسي ل LipidUNet هو حقيقة أن مجموعة بيانات التدريب ل الذكاء الاصطناعي اقتصرت على صور تكبير 40x للخلايا المزروعة في لوحة 96 بئرا. نتيجة لمجموعة صور التدريب ، يقتصر LipidUNet ، في شكله الحالي ، على تحليل صور التكبير 40x. يمكن استخدام البرنامج لتحليل صور 40x للخلايا المزروعة على أسطح استزراع أخرى إلى جانب لوحة بئر 96 ، ولكن يجب توخي الحذر لفحص أقنعة الإخراج التي تم إنشاؤها للتحقق من العتبة الدقيقة بواسطة البرنامج. ستكون هناك حاجة إلى المزيد من مجموعات الصور (بتكبيرات مختلفة) لتوسيع نطاق العينات / الصور التي يمكنها تحليلها.
يحتوي البروتوكول على عدة خطوات حاسمة. في خطوة علامة الدهون ، يجب على المستخدم التأكد من أن مركب الملصقات الذي اختاره (BODIPY ، APOE ، Nile Red) قد قام بتسمية عينته بشكل فعال. غالبا ما تكون خلايا RPE الناضجة مصطبغة بشدة ، مما قد يضعف إشارة الفلورسنت للتلطيخ المناعي للأجسام المضادة. عندما تكون إشارة مضان ضعيفة أو عندما يكون هناك الكثير من تلطيخ الخلفية ، لا يمكن ل LipidUNet تمييز قطرات الدهون بدقة. لسبب مماثل ، يجب استخدام إعدادات الاستحواذ المحددة بشكل صحيح لخطوة التصوير التلقائي للبروتوكول. إذا كانت الصور التي تم الحصول عليها ذات جودة رديئة ، فسوف تكافح LipidUNet لإخفاء الصور بشكل صحيح ، وبالتالي ، سيكون القياس الكمي غير دقيق (الشكل 6A-L). وأخيرا، تعد المعالجة اللاحقة للصور خطوة مهمة، حيث أن LipidUNet لديها متطلبات محددة للبرنامج للعمل.
عند مقارنتها بسير العمل لتحليل الدهون التي تستخدم العتبة اليدوية ، أو التقنيات التي تتضمن العتبة التلقائية في برامج مثل فيجي ، تقدم LipidUNet تقسيما غير متحيز وموثوقا عبر الصور ذات ترسب الدهون المتغير ، كما ينعكس في معدل خطأ صغير في تحديد جزيئات الدهون (الشكل 7). يسمح البرنامج للمستخدم بإدخال صور تدريب إضافية ، مما يسمح بتحليل مجموعات الصور بخلاف تلك التي تستخدم هدف تكبير 40x أو حتى تلك التي تستخدم علامة دهون مختلفة ، كما هو موضح في البروتوكول. في المستقبل ، سيتم تدريب البرنامج على تحليل صور 3D بحيث يكون القياس الكمي لحجم رواسب الدهون ممكنا. تنتشر أمراض العين التنكسية التي تنطوي على ترسب الدهون كمساهم رئيسي في علم الأمراض ، ومن المتوقع أن تزداد الحالات مع توسع عدد السكان المسنين13. ستسمح نماذج الأمراض الدقيقة وأدوات التحليل الفعالة ، كما أوضحنا في هذا البروتوكول ، بتطوير تدخلات علاجية جديدة.

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا تقع في الجزء الخلفي من العين بجوار المستقبلات الضوئية للشبكية. يلعب RPE دورا حيويا في الحفاظ على الرؤية السليمة من خلال توفير الدعم الأيضي والهيكلي للمستقبلات الضوئية. تتميز خلايا RPE السليمة بمورفولوجيا سداسية مميزة. وهي متصلة بواسطة تقاطعات ضيقة ، والتي تسمح ل RPE بالعمل كحاجز بين choriocapillaris الموجود على جانبها القاعدي والمستقبلات الضوئية الموجودة قميا. للحفاظ على النظام البيئي للشبكية ، يقوم RPE بنقل المستقلبات الرئيسية ، على سبيل المثال ، الجلوكوز ، إلى المستقبلات الضوئية بطريقة تقلل من استهلاك الجلوكوز في RPE1. بسبب هذا القيد ، يعتمد RPE على مستقلبات أخرى للحفاظ على احتياجاتهم الأيضية ، بما في ذلك الأحماض الدهنية ، والتي يحولها RPE إلى كيتونات من خلال أكسدة β2. بالنظر إلى ميل RPE إلى استخدام الأحماض الدهنية ، والتي من المحتمل أن يتم إعادة تدويرها من هضم الجزء الخارجي لمستقبلات الضوء (POS) ، كمصدر للطاقة ، فإن التغييرات الضارة في مسارات معالجة الدهون في RPE غالبا ما تؤدي إلى أمراض الشبكية التنكسية أحادية المنشأ ومتعددة الجينات3.
كما تم ربط التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض تنكسي متعدد الجينات في العين يسبب تنكس RPE ، بالالتهام الذاتي الشاذ واستقلاب الدهون في طبقة RPE الأحادية. يؤدي فشل طبقة أحادية RPE المختلة وظيفيا في معالجة نقاط البيع وأداء وظائف حرجة أخرى إلى رواسب خارج الخلية (RPE) تسمى الرواسب الخطية القاعدية (BLinD) الموجودة بين RPE وغشاء Bruch - وهي السمة المميزة لأمراض AMD. تشمل المكونات الرئيسية ل BLinD البروتينات الدهنية ، وأكثرها وفرة هو صميم البروتين الشحمي E (APOE)4. يمكن أن يؤدي تراكم الطبقات الرقيقة من BLinD إلى دروسين ناعم ، والذي يعرف بأنه أحد الأعراض السريرية ل AMD 5,6.
أظهرت عدة مجموعات أن الخلايا الجذعية المشتقة في نماذج الأمراض المختبرية التي تسبب اختلال وظيفي في RPE تتميز بتراكم الدهون دون RPE7،8،9. Hallam et al. (2017) ولدت RPE المستحثة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iRPE) من المرضى الذين يعانون من مخاطر عالية للإصابة ب AMD بسبب تعدد الأشكال في جين CFH. أظهر iRPE تراكم drusen ، كما هو موضح بواسطة APOE ، وتراكمت رواسب RPE عالية الخطورة أكبر من iRPE الناتجة عن المرضى منخفضيالخطورة 10.
لإنشاء نموذج في المختبر يلخص السمات الخلوية المميزة ل AMD ، مثل قطرات الدهون وترسب drusen ، تم إنشاء خطوط iRPE المتولدة من عينات دم المريض باستخدام بروتوكول موجه تنمويا تم نشره مسبقا11. تم إخضاع iRPE لمصل بشري متمم (CC-HS) ، وهو محلول يحتوي على السموم التأقانية التي تحاكي أحد الأسباب المحتملة ل AMD: زيادة إشارات المتممة البديلة8. تم قياس الترسب الخلوي وشبه الخلوي الناتج لرواسب الدهون باستخدام علامات الدهون والبروتين الدهني شائعة الاستخدام ، APOE ، Nile Red ، و BODIPY. من خلال هذه العلامات ، تبين أن الإشارات التكميلية المنشطة عبر CC-HS أدت إلى تفاقم تراكم الدهون في خلايا iRPE8.
لتطوير نموذج مرض تنكسي أحادي المنشأ في الشبكية ، تم تطوير خطوط iRPE من المرضى الذين يعانون من مرض Stargardt ، وهو مرض ناتج عن طفرات في جين ABCA4 في RPE. لقد ثبت سابقا أنه عندما يتم التخلص من ABCA4 ، يتراكم A2E lipofuscin ، وهو رواسب داخل الخلايا معروفة باحتوائها على مستويات عالية من الدهون الفوسفاتية ومنتجات بيروكسيد الدهون المعتمدة على الضوء ، داخل RPE12. تم تطوير خطوط خروج المغلوب ABCA4 جنبا إلى جنب مع خطوط المريض ، وكلاهما تعرض لتغذية نقاط البيع. أظهر Stargardt iRPE علم الأمراض الناجم عن البلعمة POS ، مما يدل على زيادة تراكم الدهون كميا بواسطة تلطيخ BODIPY. وخضعت مركبات RPE المستمدة من ABCA4 KO iPSCs لمعاملة CC-HS؛ أظهر القياس الكمي لإشارة BODIPY خللا في معالجة الدهون في نموذج مرض Stargardt أيضا9.
نظرا لانتشار هذه الأمراض والحاجة إلى علاجات فعالة ، إلى جانب نماذج الأمراض ذات الصلة الموضحة أعلاه ، هناك حاجة إلى إنشاء طرق قوية لتحديد فعالية العلاجات المحتملة. لتحديد رواسب الدهون بطريقة موضوعية وآلية وموحدة ، تم إنشاء برنامج قائم على التعلم الآلي ، LipidUNet ، بحيث ، عند إقرانه بأدوات تحليل القناع ، يمكن تحديد ترسب الدهون بسرعة وفعالية باستخدام العلامات الشائعة Nile Red و BODIPY و APOE. يمكن بعد ذلك تحليل الإحصائيات الموجزة التي تم الحصول عليها باستخدام خط أنابيب التحليل هذا وعرضها بيانيا ، مما يسمح بمقارنة سهلة لظروف العلاج. يظهر الرسم التخطيطي للبروتوكول في الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي للبروتوكول: تزرع خلايا RPE على صفيحة من 96 بئرا ويتم تحديها بمصل بشري نشط أو شرائح خارجية بقري منقاة لنمذجة أنواع مختلفة من تنكس الشبكية في المختبر. يتم تثبيت خلايا RPE وتلطيخها لرواسب البروتين الدهني مع النيل الأحمر ، BODIPY ، و APOE. يتم استخدام مجهر متحد البؤر للحصول على مداخن Z من جزيئات الدهون ذات العلامات الفلورية ، والتي تتم معالجتها لاحقا في إسقاطات كثافة قصوى 2D. تم تدريب خوارزمية التعلم الآلي على التعرف على جزيئات البروتين الدهني وتقسيمها بشكل صحيح. يتم إنشاء جداول موجزة تحتوي على عدد الجسيمات ومقاييس الأشكال المختلفة ويمكن استخدامها للتخطيط اللاحق والتحليل الإحصائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا السداسية الموجودة في الجزء الخلفي من العين. يوفر التغذية والدعم للمستقبلات الضوئية والشعيرات الدموية المشيمية ، ويؤدي البلعمة للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (POS) ، ويفرز السيتوكينات بطريقة مستقطبة للحفاظ على توازن الشبكية الخارجية. يؤدي RPE المختل وظيفيا ، الناجم عن الطفرات والشيخوخة والعوامل البيئية ، إلى تنكس طبقات الشبكية الأخرى ويسبب فقدان البصر. السمة الظاهرية المميزة لتدهور RPE هي الرواسب الغنية بالدهون داخل الخلايا وشبه الخلوية. هذه الرواسب هي نمط ظاهري شائع عبر الأمراض التنكسية الشبكية المختلفة. لإعادة إنتاج النمط الظاهري لرواسب الدهون لتنكس الشبكية أحادي المنشأ في المختبر ، تم إنشاء RPE المستحث المشتق من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iRPE) من الخلايا الليفية للمرضى. تم تغذية خطوط الخلايا المتولدة من المرضى الذين يعانون من مرض Stargardt ومرض تنكس الشبكية المتأخر (L-ORD) بنقاط البيع لمدة 7 أيام لتكرار الوظيفة الفسيولوجية RPE ، والتي تسببت في علم الأمراض الناجم عن البلعمة POS في هذه الأمراض. لإنشاء نموذج للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض متعدد الجينات مرتبط بتنشيط مكمل بديل ، تم تحدي iRPE مع السموم التأقانية التكميلية البديلة. تم توصيف رواسب الدهون داخل الخلايا وشبه الخلوية باستخدام أحمر النيل ، البورون ديبيروميثين (BODIPY) ، والبروتين الشحمي E (APOE). لتحديد كثافة رواسب الدهون ، تم تطوير برنامج قائم على التعلم الآلي ، LipidUNet. تم تدريب البرنامج على صور الإسقاط القصوى الكثافة ل iRPE على أسطح الثقافة. في المستقبل ، سيتم تدريبه على تحليل الصور ثلاثية الأبعاد (3D) وتحديد حجم قطرات الدهون. سيكون برنامج LipidUNet موردا قيما لاكتشاف الأدوية التي تقلل من تراكم الدهون في نماذج الأمراض.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: كشف التسبب في الضمور البقعي المرتبط بالعمر واكتشاف العلاجات المحتملة 

طريقة LipidUNet القائمة على التعلم الآلي لتوصيف وقياس رواسب الدهون باستخدام ظهارة صبغة الشبكية المشتقة من iPSC

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

يوفر هذا البروتوكول سير عمل لتحديد رواسب الدهون الملطخة ب Nile Red و BODIPY و APOE. يمكن للبرنامج المطور تحديد رواسب الدهون وقياسها تلقائيا ويعمل بشكل أفضل عندما يتم تحسين البروتوكول المحدد. تم تضمين أمثلة على RPE المتمايز بنجاح (الشكل 3A) و RPE ضعيف التمايز (الشكل 3B) ، حيث تؤثر جودة نموذج الخلية بشكل كبير على جودة تجزئة الصورة المناسبة.
تم تحديد اثنتين من العلامات الثلاث الموصوفة في البروتوكول ، النيل الأحمر و BODIPY ، كنقاط دائرية صغيرة ساطعة بشكل واضح في صور الفلورسنت (الشكل 5 والشكل 6). وستكون الصورة "الإيجابية" من البروتوكول بمثابة تحديد مناسب لهذه الرواسب المتميزة (الشكل 5A-D والشكل 5E-H). قد تظهر النتيجة "السلبية" تقسيما غير صحيح للصورة عن طريق الخطأ في مضان الخلفية كرواسب ، إما بسبب تلطيخ ضعيف (الشكل 6A-C والشكل 6D-F) أو بسبب كثافة الخلفية العالية (الشكل 6G-I).
تحتوي رواسب APOE على مجموعة متنوعة من الأحجام والأشكال ، وتظهر بيضاوية أو غير منتظمة بدلا من الرواسب الدائرية لأحمر النيل و BODIPY. هذه الرواسب هي أيضا أقل نقطا ، ويمكن أن تختلف شدة الإشارة بين الرواسب بسبب الاختلافات في نفاذية العينة. سيحدد التحديد الصحيح كل رواسب ، بما في ذلك تلك الأقل تشبعا (الشكل 5I-L) ، في حين أن التجزئة غير الصحيحة لن تلتقط هذه الرواسب (الشكل 6J-L). لذلك ، من المهم تحسين طرق التلوين والتصوير لتجنب الاختلاف الجذري. تتمثل إحدى طرق القيام بذلك في الانتباه بعناية إلى خطوات نفاذية العينة أثناء التلوين المناعي. لتحسين إشارة الفلورسنت ، يمكن تحلل الخلايا قبل التثبيت والتلطيخ المناعي ل APOE ، مما يؤدي إلى تشبع متساو وتجزئة أفضل لرواسب APOE.
كما تتوفر صور مجزأة للخلايا الناضجة على منصة استزراع بخلاف صفيحة بئر 96. تم تشغيل برنامج LipidUNet على صور الخلايا المزروعة على transwell ، وبينما يتم عتبة رواسب الدهون ، وكذلك المسام في غشاء transwell (الشكل 6M-O). بسبب التشابه في الشكل والحجم ، فإن برنامج LipidUNet في شكله الحالي سوف يخفي كل من رواسب الدهون والمسام العابرة بشكل عشوائي.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> الشكل 5: النتائج التمثيلية. (A ، E ، I) 96 RPE مطلية جيدا ملطخة بتلطيخ Hoechst النووي (الأزرق) وإما أحمر النيل (أرجواني) أو BODIPY (أخضر) أو APOE (برتقالي) وهي أقصى إسقاطات كثافة لمكدس Z. (ب، و، ي) صور إدخال التدرج الرمادي لبرنامج LipidUNet بعد معالجة الصور. (ج، ز، ك) أقنعة تم إنشاؤها بواسطة LipidUNet ، حيث يتم تحديد جميع الرواسب بشكل صحيح. (د، ح، ل) الخطوط العريضة لكل جسيم مقنع مرقمة. تسمح هذه التسميات بتوصيل كل جسيم في الصورة بإدخال في الانتشار مع البيانات الأولية. (A-D) يظهر تلطيخ النيل الأحمر ، والبرنامج قادر على التعرف على الرواسب على الخلفية بدقة على الرغم من ضعف الإشارة. (E-H) يظهر تباينا قويا بين إشارة BODIPY والخلفية ، وهو أمر مثالي. يحدد LipidUNet بشكل صحيح كل إيداع في الصورة. (I-L) يظهر إشارة APOE قوية ويمثل تباين تشبع الإشارة الذي غالبا ما يرى مع هذه البقعة. ومع ذلك ، فإن تجزئة الصورة قادرة على تحديد حدود كل إيداع APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> الشكل 6: النتائج دون المستوى الأمثل. (A ، D ، G ، J ، M) 96 RPE مطلي جيدا ملطخة بتلطيخ Hoechst النووي (أزرق) وإما أحمر النيل (أرجواني) أو BODIPY (أخضر) أو APOE (برتقالي) وهي أقصى إسقاطات كثافة لمكدس Z. (ب، ه، ح، ك، ن) صور إدخال التدرج الرمادي لبرنامج LipidUNet بعد معالجة الصور. (ج، و، ط، ل، س) الأقنعة غير الصحيحة التي تم إنشاؤها بواسطة LipidUNet. تشير الدوائر الحمراء إلى المكان الذي حدد فيه البرنامج بشكل غير صحيح رواسب الدهون. (أ-ج) معالجة Nile Red غير صحيحة لأن البرنامج قد حدد تلطيخ الخلفية على أنه إيداع. يمكن أن يحدث هذا في كثير من الأحيان عندما تكون هناك خلفية عالية ولكن القليل من رواسب الدهون في الصورة. يتم عرض مثالين على تلطيخ BODIPY: صورة ذات جودة رديئة بسبب تلطيخ BODIPY الضعيف (D-F) و (G - I) إشارة BODIPY قوية ذات خلفية عالية. في كلتا الحالتين ، لا يستطيع البرنامج التمييز بين رواسب الدهون الدائرية الصغيرة من الحلقة الدائرية الخلفية المحيطة بالنواة. في حين ينبغي تحسين تلطيخ والتصوير لتجنب هذه الأخطاء، يتم تحسين أحدث إصدار من LipidUNet إلى حد كبير لهذه الصور. (ي-ل) تجزئة APOE غير صحيحة. نظرا لأن الرواسب أكثر تنوعا في الحجم وتشبع الإشارة ، يواجه البرنامج صعوبة في التعرف على بعض الرواسب. (م-س) RPE المصنف على ترانسويل وملطخ باللون الأحمر النيل. تظهر هنا شريحة من مكدس Z مع كل من رواسب الدهون الحمراء النيلية ومسام الساقطة. البرنامج غير قادر على التمييز بين الاثنين ، كما هو موضح في الدائرة الحمراء التي تحتوي على مسام transwell والسهم الأخضر الذي يشير إلى رواسب النيل الأحمر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> الشكل 7: مقارنة أداة القناع. (أ ، ب ، ج) تم تحديد RPE 96 مطلي جيدا مع كميات متغيرة من ترسب الدهون مع أحمر النيل (أحمر). يتم إخفاء الصور باستخدام ثلاث طرق إخفاء شائعة مختلفة ، Find Maxima و Max Entropy و Renyi Entropy ، ومقارنتها بالقناع الذي تم إنشاؤه بواسطة LipidUNet. الصورة الأصلية مصحوبة بإحصاء يدوي لرواسب الدهون ، بينما تعرض الأقنعة الأعداد المتوقعة حسب كل طريقة تجزئة. تم حساب متوسط معدل الخطأ لكل طريقة تجزئة باستخدام الصيغة التالية: يعني[(|العدد المتوقع - العد اليدوي | / العد اليدوي) × 100]. يحدد القناع الذي تم إنشاؤه بواسطة LipidUNet بشكل أكثر دقة رواسب الدهون عبر الصور ذات الترسيب المتغير عند مقارنته بطرق التقنيع الأخرى (متوسط معدلات الخطأ: 23٪ LipidUnet ، 1164٪ Find Maxima ، 851٪ Max Entropy ، 203٪ Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مكون</td>
			<td>رقم القط</td>
			<td>الأسهم Conc.</td>
			<td>النهائي Conc.</td>
			<td>مل</td>
		</tr><tr><td>MEM ألفا</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>غير متوفر</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>ملحق N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>غير متوفر</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS معطل حراريا</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>غير متوفر</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>نميم نيا</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10 مللي متر</td>
			<td>0.01 مللي متر</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100 مللي متر</td>
			<td>1 مللي متر</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>البنسلين والستربتومايسين</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u / مل</td>
			<td>100 وحدة / مل</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>توراين</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50 ملغ / مل</td>
			<td>250 ميكروغرام / مل</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>الهيدروكورتيزون</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18.1 مجم / لتر</td>
			<td>20 ميكروغرام / لتر</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>تي 3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20 ميكروغرام / لتر</td>
			<td>0.013 ميكروغرام / لتر</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">الحجم الكلي ، مل</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: تكوين كاشف RPE-MM. قائمة بالكواشف والتركيزات المثلى ل RPE-MM.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies at JoVE.com

أمراض العين التنكسية التي تؤثر على طبقة ظهارة الصباغ في شبكية العين لها أصول أحادية المنشأ ومتعددة الجينات. تم تطوير العديد من نماذج الأمراض وتطبيق برمجي ، LipidUNet ، لدراسة آليات المرض ، وكذلك التدخلات العلاجية المحتملة.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

في هذه الدراسة ، نهدف إلى فهم التسبب في التنكس الكلي المرتبط بالعمر وإيجاد العلاج المحتمل له. يوفر خط الأنابيب شبه الآلي هذا لتحليل قطرات الدهون نظاما قويا لدراسة التمثيل الغذائي وأمراض الشيخوخة. يركز مختبرنا على إيجاد أهداف دوائية لعلاج AMD إما باستخدام شاشات جينية أو جزيئات صغيرة تهدف إلى تقليل تراكم رواسب الدهون.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

1.7K Views.  National Institutes of Health (NIH). في هذه الدراسة ، نهدف إلى فهم التسبب في التنكس الكلي المرتبط بالعمر وإيجاد العلاج المحتمل له. يوفر خط الأنابيب شبه الآلي هذا لتحليل قطرات الدهون نظاما قويا لدراسة التمثيل الغذائي وأمراض الشيخوخة. يركز مختبرنا على إيجاد أهداف دوائية لعلاج AMD إما باستخدام شاشات جينية أو جزيئ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: كشف التسبب في الضمور البقعي المرتبط بالعمر واكتشاف العلاجات المحتملة 

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

To begin, dissolve Nile Red powder in acetone at three milligrams per milliliter concentration. Incubate the solution for 15 minutes at room temperature with periodic mixing. Filter the solution using a 0.22-micrometer filter once or twice depending on the amount of precipitate remaining in the solution.Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-500 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution to the paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker protecting from light. After incubation, wash the samples twice with DPBS, then add 200 microliters of DPBS, and store them at four degrees Celsius.For BODIPY staining, prepare a 3.8-millimolar stock concentration by dissolving BODIPY in anhydrous DMSO. Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-300 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution of BODIPY to paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate overnight on a rocker at room temperature.The next day, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius. For APOE immunostaining, prepare a buffer solution by combining DPBS with 1%BSA, 0.5%Tween 20, and 0.5%Triton X-100. Block and permeabilize the paraformaldehyde-fixed RPE cells in 200 microliters of buffer solution for one hour.After incubation, add APPLE primary antibody diluted at one-to-100 in the buffer solution and incubate overnight at room temperature. The following day, wash the samples twice with DPBS. Then add 200 microliters of secondary antibody solution diluted at one-to-1000 for one hour at room temperature.After incubation, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius.

تلطيخ رواسب ظهارة الصباغ تحت الشبكية (RPE)

Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

Using a confocal microscope and a 40X objective, create a scan profile with the appropriate fluorescent channels for the lipid marker used. After setting up the acquisition mode and channels, optimize the focus strategy by clicking on Software Autofocus. Then set the range of the Z Stack to 20 microns.After this, optimize tiles and open the viewer to select the tile positions. Next, using a batch image processing method, create maximum projections of each Z Stack with the extended depth of focus method. Before exporting the images, set the compression to none and ensure original data is checked.The resulting image is a maximum projection gray scale TIFF of only the fluorescence channel, expressing the lipid marker. Identify the TIFF images representing either Nile Red, BODIPY, or APOE and move them into the Images folder within a directory named either Nile Red, BODIPY, or APOE, depending on the method being used. Open the lipid unit software.In the Predict tab, select the relevant directory by clicking on the ellipsis and navigating to the named directory. Confirm that lipid unit has identified the images correctly by checking the class entry. Click Predict to observe the task progress, then using the Mask Analysis tool, iterate through the generated masks and provide a quantitative count of the threshold lipid deposits from the mask images.Successful differentiation and maturation of RPE showed a confluent monolayer with pigmentation and polygonal morphology. In contrast, unsuccessful differentiation showed clusters of dying cells. In fluorescent images, Nile Red and BODIPY deposits appeared as small, bright circular points.A negative result shows incorrect image segmentation by mistaking background fluorescence as a deposit, either due to weak staining or high background intensity. APOE deposits varying in size, shape, and signal intensity and requiring optimization of staining and imaging methods to minimize variation are shown.