أثناء العمل تحت غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية ، ابدأ بغسل الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية أو PVATs التي تم جمعها من الفئران مرتين بالتتابع. أولا ، باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ بنسلين-ستربتومايسين ، وبعد ذلك ، باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل ب 1٪ بنسلين-ستربتومايسين. انقل الأنسجة المغسولة إلى طبق بتري معقم 60 ملم وأضف 200 ميكرولتر من محلول الهضم إليه.
باستخدام مقص معقم ، قم بفرم الأنسجة إلى قطع ذات أبعاد ملليمتر مكعب واحد. بمساعدة مقص معقم ، قم بقطع طرف ماصة بلاستيكي لتوسيع نهايته. ثم انقل مزيج الأنسجة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر باستخدام طرف الماصة عريض النهاية.
أضف ستة ملليلترات من محلول الهضم إلى الأنسجة لبدء عملية الهضم. بعد ربط الأنبوب أفقيا على رف ، احتضانه عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري لمدة 30 إلى 45 دقيقة. كل 5 إلى 10 دقائق ، قم بإزالة الأنبوب من شاكر في الحاضنة وهزه يدويا لأعلى ولأسفل بقوة.
مرر مزيج الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. شطف مصفاة مع حجم متساو من وسط الثقافة لزيادة غلة الخلايا وإخماد الهضم. نقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي الأنبوب لعزل جزء الأوعية الدموية اللحمية أو SVF. اقلب الأنبوب للتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. قم بطرد الأنبوب مرة أخرى عند 1،800 جم لمدة خمس دقائق قبل التخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسط الاستزراع. قم بزرع الخلايا في صفيحة من 12 بئرا مغطاة بالكولاجين واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإزالة بقايا الخلايا وخلايا الدم الحمراء عن طريق استنشاق وسط المزرعة وغسل الخلايا ببرنامج تلفزيوني مكمل بالمضادات الحيوية تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
أخيرا ، أضف ملليلترا واحدا من وسط الاستزراع الطازج إلى كل بئر ، واستمر في زراعة الخلايا حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة من التقاء.
