قياس حجم المسام وتحليل توزيع الخلايا للسقالات المشتقة من التفاح منزوعة الخلية بواسطة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر

للبدء ، اغسل سقالات التفاح منزوعة الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. لقياسات حجم المسام ، احتضن السقالات في ملليلتر واحد من محلول أبيض 10٪ calcofluor لمدة 25 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل السقالات باستخدام PBS ، استخدم مجهر مسح ليزر رنين عالي السرعة وضبط تكوين مرشح انبعاث الليزر.

اضبط طاقة الليزر والكاشف يدويا لضمان الحصول على الصورة الأمثل. احصل على مجموعة Z من 20 صورة بحجم خطوة خمسة ميكرومتر. بعد ذلك في برنامج ImageJ ، استخدم وظيفة مشروع Z إلى أقصى كثافة لإنشاء صورة وتطبيق وظيفة البحث عن الحواف لتمييز حافة المسام.

تتبع المسام يدويا باستخدام أداة التحديد اليدوي. ضع كل مسام كقطع ناقص وقم بقياس طول المحور الرئيسي. تجميع جميع القياسات وحساب متوسط الطول.

لتحليل توزيع الخلايا ، بعد غسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في الوسط المناسب ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، قم بإصلاحها باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. ثم اغسل كل سقالة جيدا بالماء منزوع الأيونات ، وتخلل الخلايا بمحلول Triton X-100 لمدة خمس دقائق واغسلها مرة أخرى باستخدام PBS. احتضان السقالات في ملليلتر واحد من 1 ٪حمض دوري لمدة 40 دقيقة وشطف بالماء منزوع الأيونات.

ثم احتضان السقالات عن طريق غمرها بالكامل في ملليلتر واحد من محلول تلطيخ. اغسل السقالات باستخدام برنامج تلفزيوني وصمة عار نواة الخلية عن طريق احتضان السقالات في محلول DAPI خمسة ملليغرام لكل ملليلتر لمدة 10 دقائق في الظلام. اغسل جيدا مرة أخرى وقم بتخزين السقالات في برنامج تلفزيوني.

تخيل السقالات المصنفة بالخلايا باستخدام مجهر مسح ليزر رنين عالي السرعة عند تكبير 10X باستخدام الإعدادات الموضحة هنا. اضبط طاقة الليزر والكاشف يدويا لضمان الحصول على الصورة المثلى والحصول على مجموعة Z من 20 صورة بحجم خطوة خمسة ميكرومتر. ثم استخدم برنامج ImageJ لمعالجة الصور متحدة البؤر واستخدام وظيفة مشروع Z إلى أقصى كثافة لإنشاء أقصى إسقاط في المحور z لتحليل الصور.

أظهر القياس الكمي للصور المجهرية متحدة البؤر توزيعا لحجم المسام بين 73 إلى 288 ميكرومتر بمتوسط حوالي 154 ميكرومتر. تراوحت غالبية المسام بين 100 و 200 ميكرومتر. بعد الاستزراع في وسط التمايز ، لوحظت رواسب معدنية في السقالات.

أظهرت السقالات المصنفة بالخلايا لونا أبيض معتما يشير إلى التمعدن ، والذي لم يلاحظ في السقالات الفارغة. علاوة على ذلك ، كشف التحليل المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر عن توزيع متجانس للخلايا داخل السقالات.