تحضير وبذر الخلايا للسقالات المشتقة من التفاح منزوعة الخلية

للبدء ، استخدم قطاعة المندولين لتقطيع تفاح ماكنتوش إلى شرائح بسمك ثمانية ملليمترات. قطع أنسجة hypanthium من شرائح التفاح إلى خمسة في خمسة ملليمترات مربعات. ضع العينات المربعة في 0.1٪ SDS لمدة يومين لإزالة الخلايا.

بعد الحضانة ، اغسل العينات بالماء منزوع الأيونات واحتضانها طوال الليل في 100 مليمول كلوريد الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة. ثم تعقيم هذه السقالات في 70 ٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة. اغسلها بالماء منزوع الأيونات وضعها في طبق استزراع 24 بئرا.

لبذر الخلايا ، استخدم MC3T3-E1 subclone 4 خلايا محفوظة في أطباق معالجة بزراعة الخلايا بقطر 10 سم في ظروف زراعة الخلايا. قم أيضا بإعداد وسط زراعة الخلايا المكون من alpha MEM المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني أو FBS و 1٪ بنسلين في الستربتومايسين. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، افصلها عن أطباق الاستزراع عن طريق التربسين.

أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 200g لمدة ثلاث دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في ألفا MEM. بعد ذلك ، ماصة من 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على سطح السقالات ، والسماح للخلايا الالتصاق لمدة ساعة واحدة في ظروف زراعة الخلايا.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر من وسط الثقافة إلى كل بئر ثقافة. قم بتجديد وسط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما ، قم بإعداد وسط التمايز بإضافة 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من حمض الأسكوربيك وأربعة مليمول فوسفات الصوديوم إلى وسط زراعة الخلية.

أضف هذه الوسيلة إلى طبق الثقافة. احتضان السقالات لمدة أربعة أسابيع للحث على تمايز خلايا MC3T3-E1 ، وتجديد الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام.