بعد 27 يوما من بدء التمايز الكبدي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، اغسل الخلايا بملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. تحضير محلول الإنزيم في المخزن المؤقت ADS باستخدام المكونات المحددة. أضف ملليلتر واحد من المحلول لكل بئر من ستة ألواح بئر.
ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية على شاكر دوار لمدة ساعتين تقريبا لفصل الخلايا عن اللوحة. تأكد من انفصال الخلية تحت المجهر ، ثم ماصة تعليق الخلية لتشتيت إلى خلايا مفردة ، وجمعها في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على وسط نضوج خلايا الكبد. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 200G لمدة خمس دقائق عند 18 درجة مئوية.
وباستخدام الشافطة ، قم بإزالة المادة الطافية. لتلطيخ الميتوكوندريا من الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط نضوج خلايا الكبد التي تحتوي على 100 نانومول TMRM. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع حمايتها من الضوء.
مرة أخرى ، قم بطرد مركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق الحبيبات في واحد إلى خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت ADS البارد الذي يحتوي على 2٪ FBS. بعد عد الخلايا ، قم بتحويل 500،000 خلية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وتسميته على أنه لا يوجد تحكم أساسي في الأجسام المضادة. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية عند 200G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وإزالة المادة الطافية.
أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة لكل مليون خلية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر واحتضان على الجليد لمدة 50 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بطرد مركزي تعليق الخلية وغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت ADS بارد يحتوي على 2٪ FBS.
أضف الآن 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة لكل مليون خلية إلى الجسم المضاد الأساسي ، الخلايا الملطخة أو غير الملوثة ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد. مرة أخرى ، قم بطرد مركزي تعليق الخلية وغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت ADS بارد يحتوي على 2٪ FBS. بعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت ADS ، قم بترشيحها من خلال مصفاة خلية غطاء مفاجئة وضع الأنبوب على الجليد.
