للبدء ، قم باستنشاق الوسائط من الآبار حيث يتم زراعة الخلايا المغلفة بالهيدروجيل في لوحة 24 بئرا. اشطف الهلاميات المائية عن طريق سحب 500 ميكرولتر من PBS مباشرة على كل بئر تحتوي على الهلاميات المائية ، ثم قم بشفط PBS برفق. باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، أضف 500 ميكرولتر من المحلول المثبت لكل بئر لإصلاح الأجسام الكروية في لوحة 24 بئرا.
اترك المثبت ينقع المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قبل سحب المحلول المثبت والتخلص منه في حاوية نفايات مخصصة. بعد ذلك ، شطف الهلاميات المائية مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. إذا لم يتم استخدامها على الفور ، قم بتخزين الهلاميات المائية في 500 ميكرولتر من PBS لكل بئر عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
للبقع في الخلايا المغلفة بالهيدروجيل ، أولا ، قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية المخففة بشكل مناسب ل nestin و SOX2. بعد استنشاق PBS من الآبار ، أضف 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة لمدة 24 ساعة لتلطيخها تماما.
ثم باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، قم بإزالة محلول التلوين وتخلص من النفايات بشكل مناسب. بعد شطف الهلاميات المائية ثلاث مرات ، قم بتخزينها في برنامج تلفزيوني عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل التصوير ، أو قم بتصويرها على الفور. لمسح الكروي الملون لتحسين شفافية التصوير ، قم أولا باستنشاق PBS من كل بئر.
ثم عالج الكرويات بالتتابع ب 500 ميكرولتر من 20٪ 40٪ و 80٪ فورماميد لكل بئر لمدة 90 دقيقة لكل منهما. أخيرا احتضان الهلاميات المائية في 100٪ فورماميد لمدة 24 ساعة قبل التصوير. تم تصوير الكائنات الكروية على أعماق متفاوتة من z-stack ، مما يسمح بتقييم صلاحية الخلية في كل موقع داخل z-stack.
يمثل الحد الأقصى للإسقاط باستخدام المكدس الكروي أعلى نقطة من شدة الضوء داخل كل موقع ، مبسطة في صورة واحدة. كشفت الصور التمثيلية للكرويات الملطخة أن عامل النسخ ذاتي التجديد ، SOX2 ، كان موضعيا مع DAPI في النواة. على العكس من ذلك ، كان عش علامة الخلايا الجذعية موجودا في جميع أنحاء الخلايا.
لم يكن هناك فرق بين الكروية العائمة الحرة بدون هلام والكرويات المغلفة ، ربما بسبب خمول هلام PEG المستخدم. كشفت الصور التمثيلية للمقاطع البصرية عند حوالي 90 ميكرون إلى كرويات تم تطهيرها وغير المسحوبة أنه عند إجراء التطهير ، يمكن تصوير النواة الكروية بحوالي 30 ميكرون أعمق مقارنة بكروية غير واضحة.
