عزل الخلايا من أدمة الفئران

قم بإجراء البروتوكول داخل خزانة السلامة الحيوية على الفأر الرحيم الذي تم حلقه وتطهيره بشكل مناسب باستخدام 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق سطحي 0.5 بوصة في بطن باستخدام المقص. قطع طوليا على طول خط الوسط نحو الرقبة وأسفل البطن.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بعمل جروح جانبية لفتح الجلد. باستخدام ملقط حاد ، افصل الجلد برفق عن الأنسجة المحيطة ، بينما يدور حول جذع ويقطع الجلد بشكل جانبي حول الرقبة وأسفل البطن. ضع الجلد بعناية بحيث يكون جانب الأدمة متجها لأسفل في لوحة زراعة الأنسجة مقاس 100 ملم.

وتأكد من تمدد الجلد قدر الإمكان. أضف ستة ملليلتر من محلول Dispase إلى اللوحة ، مع ضمان تغطية الجلد بالكامل. ثم قم بتغطية اللوحة.

لف اللوحة مع بارافيلم. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتسطيح الزرع. في اليوم التالي ، باستخدام ماصة ، قم بإزالة السائل من اللوحة التي تحتوي على الجلد المعزول.

ثم ، بمساعدة الملقط ، افصل الأدمة عن البشرة مع إزالة أي أنسجة دهنية مرئية منها. ووضع الأدمة المعزولة في طبق زراعة الأنسجة النظيفة. أضف ملليلتر واحد من DMEM يحتوي على 1X محلول مضاد حيوي مضاد حيوي إلى الأدمة في لوحة الاستزراع.

قم بإمالة اللوحة لتجميع السائل على جانب واحد من اللوحة. ثم ، فرم الأدمة إلى قطع من واحد إلى اثنين ملليمتر مربع. ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر.

أضف 10 ملليلتر من محلول كولاجيناز من النوع الثاني إلى الأنبوب. احتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع التقليب المستمر عند 30 إلى 50 دورة في الدقيقة لهضم الأدمة. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون.

وأجهزة الطرد المركزي في 250g لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليمترات من DMEM التي تحتوي على محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون قبل الطرد المركزي ، كما هو موضح سابقا.

أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة في ملليلتر واحد من وسائط LEC الكاملة. بعد ذلك ، قم بطلاء الخلايا في وسائط LEC كاملة في لوحة زراعة أنسجة مغلفة بالكولاجين مقاس 60 ملم. استبدل الوسائط كل يومين عن طريق غسل الخلايا ب PBS مرتين وإضافة وسائط LEC جديدة.

أظهرت صور التكبير المنخفضة للخلايا المعزولة من أدمة الفئران وجود خلايا مختلطة.