تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (00376) ، والمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للسرطان (NCI) [منحة R15CA231339] ، ومركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (TTUHSC) كلية الصيدلة مكتب منحة العلوم (إلى CMM) ، ومن قبل كلية الصيدلة ، تمويل بدء جامعة لويزيانا مونرو ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة [Grant P20 GM103424-21] والبرنامج الفرعي للتنافسية البحثية (RCS) التابع لمجلس حكام لويزيانا من خلال صندوق دعم مجلس الحكام (LEQSF (2021-24) -RD-A-23) (إلى GM.). تم الحصول على معدات TTUHSC الشائعة المستخدمة من خلال منح معهد أبحاث الوقاية من السرطان في تكساس (CPRIT) RP190524 و RP200572. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو قرار الكتابة أو إعداد المخطوطة. تم إنشاء الملخص الرسومي في الشكل 1A باستخدام BioRender.com.

عزل الخلايا البطانية من الشعيرات الدموية اللمفاوية الجلدية للفئران

<ol>
	<li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+vasculature+in+the+21(st)+century:+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease.">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair.">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li><li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury.">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li><li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis:+molecular+mechanisms+and+future+promise.">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li><li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lymphangiogenesis+in+cardiovascular+diseases+and+heart+transplantation.">The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation.</a> Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).</li><li>Patnam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+guidance+mechanisms+and+therapeutic+implications+in+pathological+states+of+the+cornea.">Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea.</a> Cells. 12 (2), 319 (2023).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).</li><li>Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+lymphatic+marker+LYVE-1+and+applications+in+research+into+lymphatic+trafficking+and+lymphangiogenesis.">Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenase+in+rat+pancreatic+islet+isolation.">Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation.</a> Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).</li><li>Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+preparation+and+microscopic+analysis+of+epidermis.">Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis.</a> Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+expression+is+negatively+regulated+by+miR-181+in+endothelial+cells.">Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells.</a> Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Choi, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Del-1,+an+endogenous+leukocyte-endothelial+adhesion+inhibitor,+limits+inflammatory+cell+recruitment.">Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment.</a> Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).</li><li>Mikelis, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock.">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725 (2015).</li><li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1+,+F4/80+,+CD11b++macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro:+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis.">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li><li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis.">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+of+lymphatic+vessels.">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).</li><li>Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+dysfunction,+not+aplasia,+underlies+Milroy+disease.">Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease.</a> Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).</li><li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema.">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma:+similarities+and+differences.">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues.">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li><li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis.">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).</li><li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control.">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li><li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1.">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li><li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence:+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases.">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li><li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+sprouting,+proliferation,+or+senescence:+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology.">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

الجهاز اللمفاوي هو منظم مهم لوظيفة الاستتباب في الجسم ، مع أهم الوظائف هي الحفاظ على بلازما السوائل ، وإزالة المنتجات الثانوية الأيضية الخلوية والجزيئات السامة ، وامتصاص الدهون ، والاتجار بالخلايا المناعية1،19. أثار تحديد العلامات المناسبة انفجارا في البي...

يلعب الجهاز اللمفاوي دورا محوريا في علم وظائف الأعضاء البشرية. يعتبر عاملا استتبابيا حيويا ، يسهل الوظائف المهمة ، مثل الحفاظ على توازن سائل الأنسجة والبلازما ، والمراقبة المناعية ، وامتصاص الدهون1 ، بالإضافة إلى الوظائف التي تم تحديدها مؤخرا ، مثل قدرة إصلاح القلب2 والقدرة على التجدد للعظام وتكون الدم3. على الرغم من الدور الهام للجهاز اللمفاوي ، إلا أن العديد من جوانب دور الجهاز اللمفاوي ، وكذلك الآليات الجزيئية التي تحكم بعض المعلمات والاستجابات الفسيولوجية لا تزال بعيدة المنال. علاوة على ذلك ، فإن عيوب الأوعية الدموية اللمفاوية تؤدي إلى عوامل أو تتدهور في بعض الحالات الفيزيولوجية المرضية. ومن الأمثلة المعروفة هي الوذمة اللمفية الأولية والثانوية ، اعتمادا على الأصل الجيني أو غير الوراثي للمرض ، على التوالي ، في حين أن دور الجهاز اللمفاوي في نمو الورم الأولي وانتشاره النقيلي محوري ، حيث يمكن أن يكون بمثابة قناة للورم الخبيث ومعدل وظائف المناعة1.
يرجع التأخر في دراسة ومعرفة الجهاز اللمفاوي مقارنة بالأوعية الدموية إلى الاكتشاف اللاحق للجهاز اللمفاوي مقارنة بنظام الأوعية الدموية في الدم والتأخير في تحديد العلامات الجزيئية الخاصة باللمفاوية. وقد تحسن هذا بشكل كبير في العقود الأخيرة ، مما أدى إلى تغيير الصورة التقليدية لللمفاويات في حالة مستقرة وفي ظروف مرضية1. على غرار تكوين الأوعية الدموية ، فإن تكوين الأوعية اللمفاوية هو تكوين أوعية لمفاوية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا ويلعب دورا محوريا في تطوير مجموعة واسعة من الأمراض4،5،6. ومع ذلك ، على عكس تكوين الأوعية الدموية ، اقتصر التحقيق في تكوين الأوعية اللمفاوية على نماذج الجسم الحي في الغالب التي تركز على تكوين الأوعية الدموية التنموية والعيوب الهيكلية في النماذج المرضية. يعد عزل الخلايا البطانية اللمفاوية أمرا مهما للدراسات في المختبر ، ويمكن توفير ذلك من خلال البروتوكول المقدم.
تم تطوير العديد من البروتوكولات لعزل البطانة اللمفاوية من الفئران ، والتي تتطلب استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة7. ميزة فارز الخلايا ، حيثما كان ذلك متاحا ، هي درجة أعلى من النقاء ، على عكس العزلة القائمة على الخرز ، حيث يوفر الأخير عائدا أعلى. يستخدم البروتوكول التعبير عن مستقبلات الهيالورونان البطانية اللمفاوية 1 (LYVE-1) ، وهي علامة بطانية لمفاوية ، مهمة لتهريب الخلايا داخل الأوعية اللمفاوية 4,8. نظرا لأن تعبير LYVE-1 يقتصر على الشعيرات الدموية اللمفاوية وليس الأوعية اللمفاوية المجمعة ، فإن هذه التقنية مناسبة لعزل الخلايا البطانية اللمفاوية على وجه التحديد من الشعيرات الدموية اللمفاوية ، على عكس العلامات اللمفاوية الأخرى ، مثل podoplanin ، والتي يتم التعبير عنها بشكل موحد في جميع الخلايا البطانية اللمفاوية9. بالنسبة للبروتوكول ، تم استبعاد العلامات اللمفاوية المهمة الأخرى التي لم تكن عبر الغشاء ، مثل Prox1.
نظرا لأن النتيجة الفسيولوجية كانت تكوين الأوعية اللمفاوية ، والتي تبدأ عادة في الشعيرات الدموية اللمفاوية ، فقد تم اختيار LYVE-1 كهدف بسبب انتقائيته في هذه الخلايا ولأن الجسم المضاد المختار قدم عائدا مرتفعا. كانت الإنزيمات المستخدمة هي الكولاجين من النوع الثاني ، والذي يعرف عموما أنه أكثر فعالية في تفكك الكولاجين من النوع الأول10 ، و dispase ، وهو بروتياز أوسع ، يستخدم بانتظام لفصل الأدمةوالبشرة 11. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن إنزيمات أخرى لفصل الأنسجة 12,13 ويمكن استخدامها. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لعزل الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية من الشعيرات الدموية اللمفاوية للفئران البالغة ذات الغلة العالية باستخدام تنقية الخرزة المغناطيسية ، خاصة في الأماكن التي لا يتوفر فيها فرز الخلايا المنشط بالفلورة بسهولة. هذه الطريقة مناسبة للتطبيقات التي يمكن فيها اختراق نقاء الخلايا البطانية اللمفاوية للتطبيقات النهائية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11992-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Solution (2,500 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-21D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Base Medium &#38; Supplement (LEC medium)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1432S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse LYVE-1</td>
			<td>ReliaTech GmbH</td>
			<td>103-PA50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/Shaking Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters w 0.2 &#956;m Pores</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine dermal lymphatic endothelial cell isolation

يشارك الجهاز اللمفاوي في تنظيم المراقبة المناعية وامتصاص الدهون وتوازن سوائل الأنسجة. يعد عزل الخلايا البطانية اللمفاوية للفئران عملية مهمة للبحث اللمفاوي ، لأنه يسمح بإجراء التجارب المختبرية والكيميائية الحيوية على الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك ، مكن تطوير تقنية Cre-lox من نقص الجينات الخاصة بالأنسجة التي لا يمكن استهدافها عالميا ، مما أدى إلى التحديد الدقيق لدورها في الأنسجة المدروسة. يتطلب تشريح دور جينات معينة في علم وظائف الأعضاء اللمفاوية والفيزيولوجيا المرضية استخدام محفزات خاصة بالغدد الليمفاوية ، وبالتالي التحقق التجريبي من مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة.
تمكن طرق العزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية من الفئران البرية أو المعدلة وراثيا من استخدام المقايسات خارج الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الآليات التي تنظم الوظائف اللمفاوية وتحديد مستويات التعبير للبروتينات المدروسة. لقد قمنا بتطوير وتوحيد وتقديم بروتوكول للعزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية (DLECs) عبر تنقية الخرزة المغناطيسية بناء على تعبير LYVE-1. يهدف البروتوكول المحدد إلى تزويد الباحثين بأداة لزيادة فهم وتوضيح اللاعبين المهمين في وظائف الخلايا البطانية اللمفاوية ، خاصة في المرافق التي لا تتوفر فيها معدات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

The lymphatic system plays a pivotal role in human physiology. It is considered a vital homeostatic factor, that facilitates important functions, such as the maintenance of tissue-plasma fluid balance, immune surveillance, and lipid absorption1, as well as recently-identified functions, such as the repair ability of the heart2 and regenerative capacity of bone and hematopoiesis3. Despite the significant role of the lymphatic system, several aspects of the role of the lymphatics, as well as the molecular mechanisms governing certain physiological parameters and responses remain elusive. Moreover, lymphatic vascular defects are triggering or deteriorating factors in certain pathophysiological conditions. Well-known examples are the primary and secondary lymphedemas, depending on the genetic or non-genetic origin of the disease, respectively, while the role of the lymphatic system on primary tumor growth and metastatic dissemination is pivotal, as it can act as a conduit for metastasis and modulator of immune functions1.
The lag in the study and knowledge of the lymphatic compared to the blood vasculature is mainly due to the later discovery of the lymphatic system in comparison with the blood vascular system and the delay in the identification of lymphatic-specific molecular markers. This has greatly improved in recent decades, leading to the alteration of the conventional picture of the lymphatics at steady state and in diseased conditions1. Similar to angiogenesis, lymphangiogenesis is the formation of new lymphatic vessels from pre-existing ones and plays a pivotal role in the development of a wide spectrum of diseases4,5,6. However, unlike angiogenesis, the investigation of lymphangiogenesis has been limited to mostly in vivo models focusing on developmental vessel formation and structural defects in pathological models. The isolation of the lymphatic endothelial cells is important for in vitro studies, and this can be provided by the presented protocol.
Several protocols for lymphatic endothelial isolation from mice have been developed, which require the use of fluorescence-activated cell sorting7. The advantage of the cell sorter, where available, is the higher degree of purity, contrary to bead-based isolation, with the latter providing a higher yield. The protocol utilizes the expression of lymphatic endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1), a lymphatic endothelial marker, important for cell trafficking within the lymphatic vessels4,8. Since LYVE-1 expression is limited to the lymphatic capillaries and not the collecting lymphatic vessels, the technique is suitable for the isolation of lymphatic endothelial cells specifically from the lymphatic capillaries, contrary to other lymphatic markers, such as podoplanin, which are expressed uniformly in all lymphatic endothelial cells9. For the protocol, other important lymphatic markers that were not transmembrane, such as Prox1, were excluded.
As the physiological outcome was lymphangiogenesis, which is usually initiated at the lymphatic capillaries, LYVE-1 was selected as a target due to its selectivity in these cells and because the selected antibody provided a high yield. The enzymes used were collagenase type II, which is generally known to be more effective in collagen dissociation than type I10, and dispase, a broader protease, regularly used for dermis-epidermis separation11; however, other enzymes for tissue separation have been reported12,13 and can be used. The goal of this protocol is to describe a method for dermal lymphatic endothelial cell isolation from lymphatic capillaries of adult mice with high yield using magnetic bead purification, especially in places where fluorescence-activated cell sorting is not readily available. The method is suitable for applications where the purity of lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications.

تسليط الضوء على المؤلف: العزل المغناطيسي القائم على حبة من الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية الفئران

عزل الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية للفأرين

Our group's research focuses on delineating the mechanisms regulating endothelial cell physiology. This protocol describes a method for magnetic bead-based isolation of renal endothelial cells, specifically from thermal lymphatic capillaries in facilities where fluorescence-activated cell sorting is not available. The protocol allows the isolation of lymphatic endothelial cells from transgenic mice to study their physiology in vitro.It is particularly suitable where the purity of the lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications. This process provides a high yield of lymphatic endothelial cells obtained from the lymphatic capillaries and not other collecting vessels. It is also a nice alternative in the case of the absence of cell sorting facilities.

تم تطوير الطريقة لتحديد التعبير البروتيني ل GTPase صغير ، RhoA ، تم تخبط الجين المشفر في كلا الأليلات وحذفه تحت تأثير المروج البطاني اللمفاوي المستحث لعقار تاموكسيفين Prox1-CreERT2 18. يمكن استزراع LECs المعزولة لمدة تصل إلى أربعة أجيال ، وبعد ذلك تصبح شيخوخة. لقد تم تجميدها وإذا...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation at JoVE.com

تصف هذه الورقة طريقة للعزل المغناطيسي القائم على الخرزة للخلايا البطانية للفأر من الشعيرات الدموية اللمفاوية الجلدية. يمكن استخدام الخلايا البطانية اللمفاوية المعزولة في التجارب المختبرية وتحليل التعبير البروتيني.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

تركز أبحاث مجموعتنا على تحديد الآليات التي تنظم فسيولوجيا الخلايا البطانية. يصف هذا البروتوكول طريقة للعزل القائم على الخرزة المغناطيسية للخلايا البطانية الكلوية ، وتحديدا من الشعيرات الدموية اللمفاوية الحرارية في المرافق التي لا يتوفر فيها فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. يسمح البروتوكول بعزل الخلايا البطانية اللمفاوية من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة فسيولوجيتها في المختبر.إنه مناسب بشكل خاص حيث يمكن المساس بنقاء الخلايا البطانية اللمفاوية للتطبيقات النهائية. توفر هذه العملية غلة عالية من الخلايا البطانية اللمفاوية التي يتم الحصول عليها من الشعيرات الدموية اللمفاوية وليس من أوعية التجميع الأخرى. كما أنه بديل جيد في حالة عدم وجود مرافق فرز الخلايا.

murine-dermal-lymphatic-endothelial-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

946 Views.  Texas Tech University Health Sciences Center. تركز أبحاث مجموعتنا على تحديد الآليات التي تنظم فسيولوجيا الخلايا البطانية. يصف هذا البروتوكول طريقة للعزل القائم على الخرزة المغناطيسية للخلايا البطانية الكلوية ، وتحديدا من الشعيرات الدموية اللمفاوية الحرارية في المرافق التي لا يتوفر فيها فرز الخلايا المنشطة بالفلور?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: العزل المغناطيسي القائم على حبة من الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية الفئران

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolation of Cells from Murine Dermis

Perform the protocol inside a biosafety cabinet on the euthanized mouse appropriately shaved and disinfected with 70%ethanol. Create a 0.5-inch superficial incision in the animal's abdomen using scissors. Cut longitudinally along the midline towards the neck and lower abdomen.Additionally, make lateral cuts to flap open the skin. Using blunt forceps, gently separate the skin from surrounding tissues, while going around the animal's torso cutting the skin laterally around the neck and the lower abdomen. Carefully place the skin with the dermis side facing down in a 100-millimeter tissue culture plate.And ensure the skin is as stretched as possible. Add six milliliters of Dispase solution to the plate, ensuring the skin is completely covered. Then, cover the plate.Wrap the plate with Parafilm. Incubate the plate at room temperature for 10 minutes to flatten the explant. The next day, using a pipette, remove the liquid from the plate containing the isolated skin.Then, with the aid of forceps, separate the dermis from the epidermis while removing any visible adipose tissue from it. And place the isolated dermis into a clean tissue culture plate. Add one milliliter of DMEM containing 1X antibiotic-antimycotic solution to the dermis in the culture plate.Tilt the plate to accumulate the liquid on one side of the plate. Then, mince the dermis into pieces of one to two square millimeters. And transfer them to a new 50-milliliter conical tube.Add 10 milliliters of collagenase type II solution to the tube. Incubate it for two hours at 37 degrees Celsius with continuous agitation at 30 to 50 rpm to digest the dermis. Filter the cell suspension through a 70-micron cell strainer.And centrifuge it at 250g for five minutes. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 10 millimeters of DMEM containing antibiotic-antimycotic solution. Filter the cell suspension through a 40-micron cell strainer before centrifuging, as demonstrated previously.Resuspend the resulting cell pellet in one milliliter of complete LEC media. Then, plate the cells in complete LEC media in a collagen-coated 60-millimeter tissue culture plate. Replace the media every two days by washing cells with PBS twice and adding fresh LEC media.Low magnification images of cells isolated from the murine dermis showed a mixed cell population.

عزل الخلايا من أدمة الفئران

Murine Lymphatic Endothelial Cell Purification

To purify urine lymphatic endothelial cells, use cells isolated from the murine dermis after they reach about 80 to 90%Co-fluency, begin by washing pre-coded magnetic beads in a magnetic separator using one milliliter of magnetic bead coating solution. Resuspend the beads in 150 microliters of DMEM containing 0.1%BSA. Next, wash the cells in the 60 millimeter tissue culture plate twice with PBS.Mix 50 microliters of the antibody conjugated beads with three milliliters of DMEM containing 0.1%BSA and add it to the cells. Seal the dish with biofilm, then incubate the dish on a shaker agitating at 10 RPM at room temperature for exactly 10 minutes. Discard the medium before washing the cells once with PBS.Quickly inspect the cells to verify the presence of LEC colonies on the plate. Add one milliliter of tripsin EDTA to the cells and incubate for three minutes at 37 degrees Celsius to trypsinize the cells. Inspect the cells for successful cell detachment.After neutralizing the solution with two milliliters of complete LEC media. Transfer the cell solution to a five milliliter sterile polypropylene tube. Using a magnetic separator, wash the cells with three milliliters of DMEM containing 0.1%BSA to remove unbound cells.Resuspend the remaining bead bound cells in complete LEC media and plate them onto collagen coated 60 millimeter tissue culture plates. Brightfield and fluorescence imaging easily identified the LYVE1 positive lymphatic endothelial cells after purification and showed several beads attached to them. The cells displayed low-confluency 24 hours after purification, while they were highly cofluent, seven days after purification.