زراعة الخلايا ومقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA) تحضير العينة للنشاف الغربي

للبدء ، أضف 264.7 خلية خام إلى طبق استزراع 100 ملم واحتضانها بستة ملليلتر من DMEM عند 37 درجة مئوية مع 95٪ رطوبة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، قم باستنشاق الوسط القديم ، ثم اغسل الخلايا مرتين بملليلتر من PBS الدافئ إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من PBS إلى كل طبق يحتوي على خلايا واخلطها.

اجمع الخلايا في أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، ثم جهاز طرد مركزي عند 377 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر من برنامج تلفزيوني. الآن ، قم بتجميد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في النيتروجين السائل حتى تتشكل صلبة بيضاء وتذوب على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية.

أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 12،000 غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، خذ أنبوبي طرد مركزي دقيقين ، أحدهما يحتوي على 100 ميكرومولار زانثاتين والآخر بحجم متساو من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. أضف 450 ميكرولترا من طافد الطرد المركزي إلى كل أنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم انقل 60 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب طرد مركزي دقيق إلى 14 أنبوب PCR. قم بتسخين الأنابيب في وقت واحد في درجات حرارة متفاوتة لمدة ثلاث دقائق باستخدام أنبوبي PCR عند كل درجة حرارة. ثم ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي.

الآن ، خذ 48 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب وأضفه إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 12 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل البروتين SDS-PAGE إلى كل أنبوب. سخني العينات الدوامة في حمام مائي عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.