للبدء ، ضع جميع المواد اللازمة لزراعة خلايا HEK 293 في غطاء السلامة البيولوجية النظيف. بعد ذوبان الجليد ، قم بنقل تعليق خلية HEK 293 من القارورة إلى وسط خلية تعليق سعة 30 ملليلتر تم تسخينه مسبقا في أنبوب سعة 50 ملليلتر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 80٪ و 8٪ ثاني أكسيد الكربون و 200 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.
أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 400 ميكرولتر من محلول Trypan Blue 0.4٪ واقلب الأنبوب برفق للخلط. ضع 50 ميكرولترا من تعليق الخلايا المعالجة Trypan Blue على شريحة مقياس الدم عدد إجمالي الخلايا القابلة للحياة واحسب الكمية المطلوبة من تعليق الخلية للنقل. أضف الكمية المطلوبة من تعليق الخلية إلى وسط خلية تعليق مسبقة التسخين واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 8٪ ثاني أكسيد الكربون.
أضف 1 مليون خلية لكل مليلتر HEK 293 خلية معلقة في 300 ملليلتر من وسط الخلية المعلقة واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 8٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثاني ، قم بتسخين وسط خلية التعليق والبلازميدات وكاشف النقل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف البلازميدات إلى الوسط والدوامة المحضرة لفترة وجيزة ، ثم أضف كاشف النقل والدوامة مرة أخرى لفترة وجيزة ، قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
أثناء حضانة مزيج النقل ، عد الخلايا المزروعة في اليوم الأول ، وإذا لزم الأمر ، اضبط كثافة الخلية بين اثنين و 2.5 مليون خلية لكل ملليلتر. بعد 30 دقيقة ، بالتنقيط ، أضف خليط النقل إلى الخلايا أثناء تدوير الأنبوب برفق ، واحتضانه لمدة 72 إلى 96 ساعة. في اليوم الخامس ، أضف 33 ملليلترا من محلول تحلل الخلية 10x إلى الخلايا واخلطها عن طريق الهز اللطيف.
احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة مع الهز. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 3،428 G عند أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح فراغ PES 0.45 ميكرون وجمع المحللة الموضحة في حاوية المرشح.
أضف 90 ملليلتر من محلول 40٪ PEG 8،000 إلى 360 ملليلتر من محلول الخلية المفلترة. أضف 70٪ من شريط التحريك المعقم بالإيثانول إلى الخلية المحللة وحركه عند 300 دورة في الدقيقة على الثلج أو في غرفة باردة لمدة ساعة واحدة ، ثم احتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية دون التحريك.
