إنتاج AAV المؤتلف عن طريق النقل العابر

للبدء ، HEK293T الخلايا بإضافة 22 ملليلتر من وسط الثقافة المكمل في 10 أطباق استزراع معالجة بقطر 15 سم. احتضان اللوحات لمدة 24 ساعة للوصول إلى التقاء 70 إلى 80٪. لنقل الخلايا ، قم بإعداد خليط عن طريق الجمع بين الكواشف في أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطه عن طريق النقر.

أضف خليط النقل إلى 4.56 ملليلتر من DMEM غير المكمل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر واخلطه عن طريق النقر. ثم أضف 1.37 ملليلتر من محلول البولي إيثيلين المعقم قطرة قطرة. تخلط عن طريق النقر والاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتشكيل مجمعات الحمض النووي البولي إيثيلين.

أضف هذا الخليط إلى 231 ملليلتر من DMEM المكمل قبل التسخين. استبدل وسط الاستزراع في كل طبق استزراع ب 22 مل من خليط النقل هذا ، واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة. إذا قام PITR بتشفير مراسل الفلورسنت ، فلاحظ الخلايا المنقولة تحت مجهر مضان.

بعد ذلك ، اجمع الوسيط من كل طبق. أجهزة الطرد المركزي في 800G لمدة 10 دقائق وإزالة طاف. ثم أضف 10 ملليلتر من PBS المسخن مسبقا إلى اللوحة واستخدم مكشطة الخلايا لإزالة الخلايا.

اجمع تعليق الخلية في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على حبيبات الخلية. تأكد من جمع جميع الخلايا عن طريق غسل خمسة أطباق في وقت واحد باستخدام 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لبيليه الخلايا.

لاستخراج rAAV ، قم بإذابة كريات الخلايا المنقولة وأعد تعليقها في 100 ملليلتر من المخزن المؤقت المعقم والماصة لضمان تعليق متجانس. بعد ذلك ، أضف 12.5 ملليلتر من محلول ديوكسي كولات الصوديوم المعقم حديثا بنسبة 10٪ للحث على تحلل الخلايا واخلطه عن طريق الماصة. أضف 27 ميكرولترا من نينوكلياز البنزوناز واخلطه جيدا حتى يصبح الخليط غير لزج.

احتضان عند 37 درجة مئوية ، دوامة كل 10 دقائق ، لمدة ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي في 3،000G لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح حقنة PVDF 0.45 ميكرون في حاوية معقمة جديدة.