للبدء ، قم بإعداد نظام FPLC للتنقية. شطف مسار تدفق السائل جيدا بالماء المعقم عالي النقاء باستخدام التعليمات اليدوية أو طريقة مخصصة. قم بتوصيل عمود هيبارين معبأ مسبقا بالمليلتر واحد.
اضبط إنذار الضغط. ويغسل بخمسة أحجام أعمدة من الماء عالي النقاء بمعدل تدفق واحد ملليلتر في الدقيقة. ثم قم بتبديل حلول مضخات النظام للتحضير لتطبيق العينة.
اغسل مضخة النظام B باستخدام المخزن المؤقت B واملأ بقية مسار تدفق السائل باستخدام Buffer A.أدخل أنبوب العينة لمضخة العينة في المستحضر الفيروسي. بدلا من ذلك ، استخدم حلقة فائقة للعينة. أدخل أنبوب المخرج في حاوية جديدة.
عند إجراء التنقية لأول مرة ، حدد طريقة مخصصة للتنقية التلقائية. بعد تمكين إعدادات التنقية العامة ، ستقوم الطريقة بتهيئة مسار التدفق من مدخل العينة S1 إلى صمام الحقن بمحلول العينة. ثم قم بموازنة العمود بإجمالي خمسة أحجام أعمدة باستخدام 12.5٪ من Buffer B بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة.
ضع العينة على العمود بمعدل 0.5 ملليلتر في الدقيقة واجمع التدفق من خلال استخدام منفذ المخرج. اغسل العمود ب 20 وحدة تخزين عمود من Buffer A بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة. ثم قم باستئصال العينة بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة باستخدام هذا المخطط.
حدد لجمع العينة المستخلصة في كسور ملليلتر واحد باستخدام جامع الكسور. ثم أعد موازنة العمود عند ملليلتر واحد في الدقيقة مع 12.5٪ من المخزن المؤقت B لخمسة أحجام أعمدة. افتح الطريقة التي تم إنشاؤها وانتظر خطوة الشطف.
اجمع الكسور باستخدام جامع الكسور. أيضا ، اجمع حصة من التدفق وخزن الكسور عند سالب 20 درجة سلزية. قم بتقييم الكروماتوجرام المحفوظ تلقائيا لجميع خطوات التنقية.
بما في ذلك ملف تعريف الشطف. بعد الانتهاء ، قم بتبديل المداخل من المحاليل العازلة إلى الماء عالي النقاء واغسل العمود بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة لخمسة أحجام أعمدة. استعادة العمود ، قم بتبديل المداخل من الماء عالي النقاء إلى 20٪ إيثانول واغسل العمود لخمسة أحجام أعمدة.
لتركيز rAAVs ، قم بتحميل كسور FPLC المطلوبة في وحدة مرشح طرد مركزي سعة 15 ملليلتر مع قطع وزن جزيئي 100 كيلو دالتون. أجهزة الطرد المركزي عند 2،000 G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى حجم مركز يبلغ حوالي 500 ميكرولتر. استمر في تبادل المخزن المؤقت عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS المعقم إلى وحدة مرشح الطرد المركزي.
اغسل الفلتر عن طريق الماصة. وأجهزة الطرد المركزي في فواصل دقيقة واحدة حتى تصل إلى حجم 500 ميكرولتر. قم بزيادة تركيز rAAVs عن طريق نقل عينة 500 ميكرولتر هذه إلى وحدة مرشح طرد مركزي 0.5 ملليلتر مع قطع 100 كيلو دالتون.
والطرد المركزي عند 6،000 G لمدة دقيقة واحدة حتى يصبح الحجم أقل من 100 ميكرولتر. استعادة rAAV المركزة عن طريق قلب جهاز المرشح إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد ، والطرد المركزي لنقل rAAVs إلى الأنبوب. قم بقسمة rAAVs في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الاحتفاظ وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
تم تحليل نقاء مستحضرات rAAV باستخدام صفحة SDS ، وكشفت عن نطاقات بروتين قفيصة مميزة. أظهر تصور الجسيمات الفيروسية بواسطة TEM جزيئات فارغة ذات مركز كثيف للإلكترون وجزيئات كاملة. كشف تقييم خصائص الشوائب الفيزيائية ل rAAVs باستخدام المنصة المذهلة عن جزيئات قفيصة سليمة حوالي 30 نانومتر ، وعيار قفيصة إجمالي ، وبروتين حر ومجمعة ، وحمض نووي أحادي تقطعت به السبل.
أظهرت فحوصات العدوى في الخلايا العصبية 2a مستويات عالية من العدوى. أظهرت الثقافات العصبية الأولية المصابة بالمستحضرات الفيروسية. الحفاظ على خصائص نقل الجينات.
أدى نقل مخيخ الفئران في الجسم الحي مع ناقلات rAAV إلى تعبير GFP لفترات طويلة. مما يشير إلى نجاح التعبير الجيني في دماغ الثدييات.
