للبدء ، قم بترتيب المواد التجريبية المطلوبة على منصة العمل. أضف 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين المعقم 0.4٪ إلى آبار صفيحة سفلية سوداء الجدران 96 واضحة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة.
تحت المجهر المقلوب ، تأكد من أن الخلايا البطانية في قارورة T75 متقاربة بنسبة 80 إلى 100٪. قم بإزالة وسيط DMEM الكامل من القارورة عن طريق الشفط. لغسل الخلايا ، أضف 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وهز القارورة برفق.
استبدل برنامج تلفزيوني بخمسة ملليلتر من محلول تفكك الخلايا. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 دقيقة تقريبا. اضغط على القارورة بعد ست دقائق.
للمساعدة في تسهيل التفكك. أضف خمسة ملليلتر من الوسط الكامل DMEM المسخن مسبقا إلى القارورة ، وامزج تعليق الخلية. باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 150 جم لمدة خمس دقائق.
في غضون ذلك ، باستخدام ماصة قس متصلة بفراغ ، قم باستنشاق محلول الجيلاتين من لوحة البئر 96. بعد الطرد المركزي للخلايا ، قم بإزالة supernatin من الأنبوب دون إزعاج الحبيبات. باستخدام ماصة مصلية ، أضف ثمانية ملليلتر من وسط DMEM الكامل الطازج إلى الأنبوب ، وقم بسحب الماصة برفق من المعلق لتفتيت حبيبات الخلية.
عد الخلايا باستخدام التعثر الأزرق على مقياس الدم. أضف وسط DMEM الكامل لعمل كثافة 600،000 خلية لكل تعليق ملليلتر. امزج تعليق الخلية عن طريق قلب الأنبوب برفق.
أضف تعليق الخلية إلى خزان ماصة متعدد القنوات سعة 50 ملليلتر. كل 30 ثانية ، قم بهز الخزان برفق من جانب إلى آخر لخلط التعليق واستخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر من 96 لوحة بئر مطلية بالجيلاتين. استبدل غطاء اللوحة الشفاف وهز اللوحة برفق عن طريق تحريكها على سطح الغطاء المعقم من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 إلى 24 ساعة.
