للبدء ، ضع وسيط التصوير المسخن مسبقا وأطباق الفحص المجهري المعقمة مع أسطح زجاجية مغلفة أو غير مطلية على منصة عمل. بعد إزالة الوسط المحيط بقالب الأغاروز ، أعد تعليق محتوى القوالب بعناية في وسائط 190 ميكرولتر قبل نقل الأجسام الكروية العائمة إلى قارورة سعة 2 ملليلتر. بالنسبة للكرويات الموجودة في صفيحة منخفضة التعلق ، انقل الأجسام الكروية واحدة تلو الأخرى من الآبار الفردية إلى قارورة.
اسمح للكرويات بالاستقرار في قاع القارورة لمدة خمس دقائق ، لتشكيل حبيبات مرئية. قم بإزالة الوسائط من القارورة ، وترك الكائنات الكروية دون إزعاج ، وأعد تعليقها برفق في كمية كافية من وسيط McCoy's 5A الجديد. الآن ، قم بنقل حجم متساو من التعليق الكروي لكل بئر من طبق الفحص المجهري.
احتضان كروي لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. أضف مسبارا مضانا إلى حجم معروف من التعليق الكروي واستمر في الحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، تبادل الوسائط التي تحتوي على مجسات الفلورسنت مع الحجم اللازم من وسائط التصوير.
ابدأ تشغيل برنامج التحكم في المجهر وقم بتهيئة معايرة المرحلة. ثم اختر الهدف المطلوب. اختر النافذة فتح مشروع وانقر فوق إنشاء مشروع جديد.
ثم ، انقر بزر الماوس الأيمن على المشروع الذي تم إنشاؤه حديثا وحدد خيار إعادة تسمية في القائمة المنسدلة. أعط اسما قياسيا لملف مشروع البحث. افتح نافذة الاستحواذ.
اضبط الطول الموجي لإثارة الليزر بالضوء الأبيض النبضي والنطاق المطلوب من كاشفات المسح الهجين أو الرنين. ثم اختر أنواع الخطوط أو الإطارات للمسح الضوئي. في نافذة الاستحواذ، حدد وضع FLIM لإجراء التصوير جنبا إلى جنب مع عد الفوتونات.
ثم اختر معدل تكرار نبض ليزر الضوء الأبيض. ابدأ معاينة التصوير باستخدام وضع Fast Live واضبط التركيز البؤري الدقيق لكائن التصوير على قسم مهم. من خلال النظر إلى الرسم البياني لشدة البكسل ، اضبط حجم ودقة ثقب الليزر المناسبين.
أثناء وجودك في Fast Live ، قم بتعيين الإحداثيات واتجاه المسح الضوئي ونسبها للبدء والانتهاء في نافذة Z-Stack. اختر حجم خطوة z أو عدد الخطوات. بمجرد تطبيق جميع الإعدادات اللازمة ، ابدأ التصوير.
أعط الصورة اسما مناسبا واحفظ مشروع التصوير. أدت طرق التكوين المختلفة إلى أحجام كروية متفاوتة. كانت كرويات HCT116 في لوحات التعلق المنخفضة أكبر بكثير بعد خمسة أيام مقارنة بطرق الإنتاجية العالية.
أدت طرق التعلق المنخفضة إلى التطور الواضح لنواة نخرية تم اكتشافها بواسطة تلطيخ يوديد البروبيديوم. في المقابل ، أظهرت الأجسام الكروية المتولدة بطرق أخرى التوزيع المنتشر للخلايا الميتة عبر الجسم الكروي. أظهر الأوكسجين في كرويات HCT116 المنتجة بطرق مختلفة كروية مؤكسجة مع الأنسجة الدقيقة والقوالب الدقيقة المصنوعة في المختبر أكثر من الصفيحة الكروية 5D.
أظهر الأوكسجين الكروي للكرويات الكروية 5D أكسجة أقل مقارنة بالأنسجة الدقيقة والقوالب الدقيقة المصنوعة في المختبر. يكشف تحليل Phasor للكرويات HCT116 المصنوعة باستخدام ألواح منخفضة التعلق عن وجود نوى تحلل السكر وغير المحللة للسكر عبر فوتونين NADPH-FLIM.
