مقايسة تنبت كروية للخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري (HUVECs) للتحقيق في تكوين الأوعية في المختبر

للبدء ، أضف HUVECs إلى أنبوب فالكون سعة 10 ملليلتر يحتوي على ثمانية ملليلتر من وسط النمو البطاني. أضف ملليلتر من محلول مخزون METHOCEL في الأنبوب ورجه جيدا. بعد ذلك ، انقل 25 ميكرولترا من الخليط إلى السطح الداخلي المقلوب لطبق بتري كبير مربع.

قم بتدوير الغطاء برفق بمقدار 180 درجة وضعه في قاع وعاء زراعة الخلايا واحتضانه طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف 2.3 ملليلتر من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول إلى قارورة تحتوي على 0.28 ملليلتر من 10X Medium 199. الحفاظ على هذا الخليط على الجليد وتخلط حتى يصبح لونه أصفر بالتساوي.

قم بمعايرة الخليط مقابل هيدروكسيد الصوديوم حتى يتحول إلى اللون البرتقالي. ثم أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت HEPES إلى المنتج النهائي. اجمع الخلايا المستزرعة المعلقة في أنبوب فالكون سعة 50 ملليلتر مع 20 ملليلتر من PBS ، ثم أجهزة الطرد المركزي.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 0.1 ملليلتر من FBS و 0.4 ملليلتر من الوسط القاعدي البطاني إلى الحبيبات الكروية. اضغط برفق على الأنبوب لإعادة تعليق الحبيبة. الآن ، ماصة ملليلتر من محلول الأسهم METHOCEL وتخلط جيدا.

ثم أضف ملليلتر من خليط الكولاجين المحضر إلى الكرويات المعلقة. الاستغناء عن 0.5 ملليلتر من الخليط الناتج في آبار لوحة 24 بئر واحتضانها. بعد ذلك ، ماصة 100 ميكرولتر من عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية المؤتلف المخفف في آبار اللوحة.

احتضان مزرعة الخلية عند 37 درجة مئوية تحت مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 12 ساعة. في اليوم التالي ، باستخدام مجهر مقلوب ، التقط صورا للكرويات غير الملامسة لحافة البئر ، مع بعضها البعض ، أو تظهر عليها علامات التلف. كانت الكرويات المحفزة بعامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية المتوسطة القاعدية أو المؤتلفة فقط مميزة بوضوح.

يبدو أن الأجسام الكروية في المواد الهلامية منخفضة الجودة تسقط على الأرض وتفرقت. أظهر التحكم السلبي معدل إنبات خط الأساس المعتدل بينما ضاعف عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية أو ثلاثة أضعاف طول النبتة النسبي. أظهر عدد البراعم نطاقا ديناميكيا مشابها.