وأيد هذا العمل من قبل جائزة بوروز ويلكوم شهادة في العلوم الطبية الحيوية (AKM) ، ومؤسسة البحوث وايتهول غرانت (AKM) ، زمالة مؤسسة سلون (AKM) ، NIH EY019277 (AKM) ، وNEI الممولة ، والرؤية المنح التدريبية وEY013319 ( EAK).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الخلايا العصبية في الدماغ سليمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ، والتحضير حيث وصفت الخلايا العصبية مع علامات الفلورسنت المستخدمة. في التجارب المقدمة هنا نستخدم الماوس المعدلة وراثيا GFP - M الذي تسميات خط طبقة الخلايا الهرمية 5 1. طبقة 5 خلايا هرمية المشروع شجيري العمليات في الطبقات السطحية ، والسماح للتصور من التشعبات والعمود الفقري شجيري يصل إلى عمق 300 ميكرومتر دون مستوى الحنون. نهج بديل يتمثل في استخدام الخلايا تسمية علامات الفيروسية (انظر لوري وآخرون ، التي قدمت إلى إن الرب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم مساحة العمل باستخدام الايثانول 70 ٪ وأدوات تعقيم لجراحة العقيم. تغطية التشغيل السطح مع خلع الملابس النظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع كوكتيل الفنتانيل (الفنتانيل 0.05 ملغم / كغم ؛ الميدازولام 5 ملغ / كلغ ؛ metatomadin 0.5 ملغ / كلغ) ، تليها جرعة ربع AVERTIN (0.0075 ملغم / لتر) باستخدام IACUC الإجراءات المعتمدة. يمهد للمعالجة الفئران مع المسكنات ، والبوبرينورفين (0.5 ملغ / كلغ) تدار تحت الجلد (SQ). رصد مستوى الطائرة مخدر اختبار رد الفعل الى الذيل / اصبع قرصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوانات في 37.5 درجة مئوية باستخدام بطانية للتدفئة مع ترمومتر المستقيم المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع العينين من الجفاف. عيون هود مع ورقة صغيرة من الورق لحماية العينين من مصدر الضوء أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص ، وإزالة الشعر من مؤخرة الرأس (خلف الأذن) في العينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتبع تنظيف الجزء العلوي من الرأس الحيوان مع التطبيق متتابعة من الايثانول 70 ٪ ، عن طريق فرك betadine betadine والحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق L - قطع خلف الأذنين وعلى طول الجانب إما الأيمن أو الأيسر من خط الوسط (اعتمادا على نصف الكرة الأرضية الذي سيتم تصويره) في العينين. طية الجلد أكثر من موقع ، وبعيدا عن الجراحة. لا تقم بإزالة الجلد حيث سيتم خياطة الجلد التالية للدورة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط غرامة برفق الجلد وحتى بعيدا من اهتماماتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف بعيدا سمحاق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة مع ملقط نظيف أو شفرة المجهرية. استخدام مسحة القطن ، وتطبيق كمية صغيرة من كلوريد الحديديك 10 ٪ في الجمجمة حتى يجف تماما الغشاء سمحاق وضمان أنه قد تم إزالته تماما. من المهم أن الجمجمة جافة تماما لضمان الالتزام السليم من الغراء (انظر 11). باستخدام الملقط أو شفرة المجهرية ، كشط بلطف بعيدا المجففة غشاء السمحاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate حول نافذة التصوير من الواح الصلب غير القابل للصدأ الرأس (انظر الشكل 1) ويلصق لوحة في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهاية باستخدام عصا خشبية من القطن المسحة ، وتطبيق الغراء لطبقات داخل إطار التصوير ، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الصمغ التسريع في النافذة. يمسح بسرعة بعيدا الزائدة التسريع الغراء مع مسحة القطن أو مسح كيم. يجب أن يكون الغراء توطد تماما قبل الحفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ رقيقة الجمجمة في إطار التصوير باستخدام حفر الأسنان الملصقة مع 0.7 مم لدغ الفولاذ المقاوم للصدأ. حفر بديلة مع التطبيق أحيانا عقيمة المالحة 0.9 ٪ لتجنب توليد الكثير من الحرارة على الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة ملم 4X4 نافذة على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة على سطح الجمجمة مع حفر الأسنان. اختبار ركاكة من الجمجمة مع ملقط نهاية حادة. سوف سطح الجمجمة البادئة قليلا مع ضغط لطيف. سمك الجمجمة الأمثل لتصوير ما بين 10 و 30 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الجمجمة هي رقيقة والإطار تنظيفها من كل الحطام والمكان المالحة على الجمجمة. صورة نافذة التصوير مع الكاميرا الرقمية التي شنت على نطاق وتشريح. والتصوير الفوتوغرافي واستخدام الأوعية الدموية في الدماغ تساعد في تحديد مكان وجود موقف لوضع لوحة التصوير لجلسات التصوير لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات إلى تلاعب 2 - الفوتون. ينبغي أن تبقى على الحيوان بطانية للتدفئة (المستقيم مع التحقيق) خلال الدورة التصوير بأكمله. ملاحظة : عندما تكون تحت التخدير ، ودرجة حرارة جسم الحيوان الأساسية سوف تتقلب بشكل كبير في غياب وحدة التدفئة مما أدى إلى أضرار القشرية أو ربما الموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم مجهر ثنائي الفوتون مع ليزر ماي تاي ، وهو 10W مضخة الحالة الصلبة لأقصى قدر من السلطة وأوليمبوس تعديل وحدة مبائر Fluoview. تم تحسين نظام للتصوير الأنسجة العميقة ويتم تثبيت كاشفات الخارجية أقرب إلى الهدف ممكن للسماح للكشف القصوى لمضان من الدماغ. يتم استخدام LUMPlan أوليمبوس الهدف 20X/0.95NA فلوريدا / IR العدسة. وتستخدم المياه المالحة 0.9 ٪ خلال التصوير لغمر الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هذا المجهر ، وتقريب رقمي منخفضة (X1) تحديد منطقة تحتوي على الخلايا العصبية المسماة الزاهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكاميرا الرقمية الملصقة على قطعة المجهر العين ، ويلتقط صورا للمنطقة التصوير. بدلا من ذلك ، يرسم نمط الأوعية الدموية في الدم. هذا أمر ضروري لإعادةأنتقل إلى موقع التصوير نفسه في نقطة زمنية لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المكدس التكبير المنخفض (X20 الهدف ، 512x512 بكسل ، 5 الخطوة ميكرون) من خلال مدى مرئية بالكامل من الدماغ (الذي يمتد عادة ~ 200 ميكرون) مما يبين مدى تشعب شجيري. ملاحظة : سيتم استخدام هذه الصورة التكبير المنخفضة لتحديد منطقة التصوير في نقاط وقت لاحق كما الأوعية الدموية على حد سواء ، والحفاظ على هيكلها التشعبات في الحيوانات الصغار والكبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير باستخدام برنامج (Fluoview ، V. 5.0 ، FV300) ، وزيادة التكبير الرقمي 8 أضعاف. ضبط إحداثيات س ، ص (PAN إحداثيات) إذا لزم الأمر ، وجمع كومة التكبير العالية التي سوف تظهر مورفولوجيا شجيري مفصلة بما في ذلك مواقع وهيكل العمود الفقري شجيري. تدوين ملاحظات مفصلة عن كل مجموعة مكدس ، أي عموم الإحداثيات ، ومجموعة من جمع وحجم ض خطوة وعدد من الخطوات في الكدسة. وسيتم استخدام هذه الملاحظات عند عودته الى هذا تغصن أو محور عصبي في نقطة زمنية لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير ، وإزالة لوحة فصل رأسه بلطف لوحة من سطح الجمجمة. باستخدام الملقط ، وإزالة أي بقايا الغراء المتبقية على سطح الجمجمة والجمجمة مع مسح المالحة عقيمة 0.9 ٪. خياطة الجلد فوق الجمجمة معا باستخدام # 6 الصفحات خياطة. مسح المنطقة مع الايثانول 70 ٪. لتخفيف الألم أثناء التعافي بعد الجراحة ، وإدارة مسكن البوبرينورفين 0.1 ملغ / كلغ ، SQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الحيوان في القفص نظيفة تحت مصباح الحرارة حتى يستيقظ ، والمحمول. عودة إلى قفص الحيوان الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوان reimage في وقت لاحق نقطة (نقطة وقتنا ويمكن في أي مكان التصوير في الفترة من 2 إلى أيام عدة أشهر بعيدا) ، إزالة أو إعادة فتح غرز الجلد على الرأس باستخدام أساليب العقيم على النحو الوارد أعلاه. استخدام الصور الرقمية من الأوعية الدموية في الدماغ (التي اتخذت في تاريخ الجراحة الأولى) لتحديد موقع التصوير الأصلي. Reaffix headplate الفولاذ المقاوم للصدأ (الخطوات 10-12). استخدام شفرة المجهرية رقيقة بلطف بعيدا أي العظام التي قد تكون إعادة نمت بين نقاط وقت التصوير. إذا لزم الأمر ، رقيقة مع حفر الأسنان. نافذة واضحة التصوير من الحطام وتطبيق قطرة من المياه المالحة عقيمة 0.9 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمل الحيوانات لاثنين من الفوتون المجهر وتحديد مجال التصوير الأصلي. استخدام الصورة الرقمية التي اتخذت خلال الدورة الأولى للتصوير المساعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج وفتح Fluoview الأصلي صورة التكبير منخفضة. لصق ورقة الشفافية على شاشة الكمبيوتر والرسم والاوعية الدموية الرئيسية النمط باستخدام قلم الشفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة الحية ويعيد تنظيم الدم الأوعية الدموية للنمط رسمت على الفيلم الشفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لreimage 8X والتكبير في الهياكل ، وفتح المكدس المطلوب جمعها من الدورة السابقة التصوير. رسم الهيكل (أي محواري ، شجيري ، الدبقية) على فيلم والشفافية ، والملصقة على شاشة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكبير 8X من صورة حية وتعيين الإحداثيات لعموم المعلمات يوم التصوير الأول. اعتمادا على دقة محاذاة موقع التكبير منخفضة ، قد يكون من الضروري أيضا ضبط زاوية من الصورة قليلا. مرة واحدة تم العثور على الهيكل المطلوب ، لتصل المباراة إلى الهيكل الخاص رسمت نمط التكبير عالية. جمع ض المكدس مع حجم خطوة مماثلة ، وعدد من Z - المكدس لتحليل الصور اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 29 و 30 حتى يتم كل الصور عالية التكبير إعادة جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال التصوير ، كرر الخطوات من 22-24. ويمكن تكرار إعادة التصوير بسرعة تصل الى 2 نقطة زمنية منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها الحظيرة وشعبة الطب مختبر الحيوان من جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان ، والاعتماد الكامل من قبل الرابطة لتقييم واعتماد المختبرات رعاية الحيوان ، الدولية (AAALAC) وامتثالا لدولة القانون ، القانون الفيدرالي ، وسياسة المعاهد الوطنية للصحة. </li></ol> ممثل النتائج في GFP - M معربا عن الفئران ، يمكن أن مجموعة فرعية من طبقة الخلايا الهرمية 5 والعمليات المقابلة شجيري يمكن بسهولة تصور باستخدام 2 الفوتون المجهري مسح الليزر (2PLSM) 1. تظاهر هنا لدينا إعداد ضعفت - الجمجمة التي ضعفت الجمجمة حول موقع التصوير المطلوب ل10-30 ميكرومتر ~. بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، علينا وضع تصور واضح والتشعبات القشرية العمود الفقري في القشرة البصرية سليمة للتحليل حاد أو مزمن (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. لوحة مخصصة الرأس والقاعدة : (أ) أعلى عرض مخصص رأس وقدم لوحة الأساسية المستخدمة لإعداد جراحة ضعفت - الجمجمة. (ب) عرض الجانب العرف من صنع لوحة الرأس والقاعدة. (C ، D) وصورة تخطيطية تفصيلية لوحة الرأس. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 2. ممثل عن النتائج التالية 2PLSM رقيقة إعداد الجمجمة (A) الانشعابيات المصورة في الجسم الحي في القشرة البصرية للماوس GFP - M المعدلة وراثيا باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. الصورة هي صورة واحدة من الإسقاط حصل كل من 5 ميكرون الحنون إلى عمق النهائي من 175 ميكرون. محاصر في المنطقة ويمثل المنطقة في تضخيم (B) و (C) التقط في اليوم 0 (D0) وبعد ذلك بأربعة أيام (D4). خسر (D ، E) التكبير العالي فرع شجيري محاصر في وباء وجيم يتظاهرون أشواك مستقرة (رؤوس السهم الأبيض) ، والعمود الفقري التراجع / (رؤساء السهم الأحمر) ، والعمود الفقري جديدة (رؤساء السهم الأخضر). أشرطة النطاق = 200 ميكرومتر ألف وباء وجيم 20 ميكرون ، D ، E. 5 ميكرون.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التصوير المزمنة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري أصبحت تقنية شعبية متزايدة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثار خلال اللدونة 2-5. هنا علينا أن نظهر استعدادا ضعفت - الجمجمة لمتابعة العمود الفقري شجيري التي تم تحديدها في مخ الفأر سليمة في أيام التصوير المختلفة. في ...

<table><tbody><tr><td>Fentanyl Citrate</td><td></td><td>In House</td><td></td><td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;&lt;br/&gt;IP Dose: 0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>Medetomindine Hydrochloride</td><td></td><td>In House</td><td></td><td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;&lt;br/&gt;IP Dose: 0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCL</td><td></td><td>In House</td><td></td><td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;&lt;br/&gt;IP Dose: 0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribrom&amp;#8211;thanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin Cocktail: Anesthetic;&lt;br/&gt;IP Dose: 0.0075 cc/ g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final cocktail conc.: 1%</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin Cocktail: Anesthetic;&lt;br/&gt;IP Dose: 0.0075 cc/ g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final cocktail conc.: .775%</td></tr><tr><td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Mouse</td><td>Body Temp. Regulation</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>In House</td><td></td><td>Eye Ointment</td></tr><tr><td>10% Ferric Chloride</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>Microsurgical Blade</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>Zip Kicker Glue Accelerator</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>Thin-skull preparation</td></tr><tr><td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Taper C-1</td></tr><tr><td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td><td>Surgical Tools</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td><td>Surgical Tools</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td><td>Surgical Tools</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

المجراة في التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (2PLSM) يسمح لدراسة الخلايا الحية وعمليات الخلايا العصبية في الدماغ سليمة. التقنية المقدمة هنا يسمح التصوير من نفس المنطقة من الدماغ في الوقت عدة نقاط (التصوير المزمنة) مع قرار السماح للالمجهرية تتبع في العمود الفقري شجيري التي هي هياكل الصغيرة التي تمثل الغالبية العظمى من المواقع مثير بعد المشبكي في الجهاز العصبي المركزي. القدرة على حل بوضوح الهياكل القشرية غرامة على نقاط عدة مرات العديد من المزايا ، وتحديدا في دراسة الدماغ في اللدونة التي تغيرات شكلية في نقاط الاشتباك العصبي ، وإعادة تشكيل الدوائر قد يساعد في تفسير الآليات الكامنة. في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للمزمنة في الجسم الحي من تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة. إعداد ضعفت - الجمجمة هو نهج مينيملي ، الذي يتجنب احتمال حدوث تلف و / أو قشرة الجافية ، وبالتالي تقليل ظهور رد فعل للالتهابات. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، فمن الممكن لرصد التغيرات في الخصائص بوضوح شجيري العمود الفقري في الدماغ سليمة على مدى فترة طويلة من الزمن.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للالمزمنة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة.

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  University of Rochester. في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للالمزمنة في الجسم الحي تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة.

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

بدء تصوير دبقي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; من خلال نافذة رقيقة الجمجمة ملمع وعززت القحف

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Medicine

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

طولي<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من Cerebrovasculature: الأقرب للأمراض الجهاز العصبي المركزي

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Immunology and Infection

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

بدء تصوير دبقي

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل

الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون

ثنائي الفوتون

طولي

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة