وأيد هذا العمل من قبل جائزة بوروز ويلكوم شهادة في العلوم الطبية الحيوية (AKM) ، ومؤسسة البحوث وايتهول غرانت (AKM) ، زمالة مؤسسة سلون (AKM) ، NIH EY019277 (AKM) ، وNEI الممولة ، والرؤية المنح التدريبية وEY013319 ( EAK).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الخلايا العصبية في الدماغ سليمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ، والتحضير حيث وصفت الخلايا العصبية مع علامات الفلورسنت المستخدمة. في التجارب المقدمة هنا نستخدم الماوس المعدلة وراثيا GFP - M الذي تسميات خط طبقة الخلايا الهرمية 5 1. طبقة 5 خلايا هرمية المشروع شجيري العمليات في الطبقات السطحية ، والسماح للتصور من التشعبات والعمود الفقري شجيري يصل إلى عمق 300 ميكرومتر دون مستوى الحنون. نهج بديل يتمثل في استخدام الخلايا تسمية علامات الفيروسية (انظر لوري وآخرون ، التي قدمت إلى إن الرب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم مساحة العمل باستخدام الايثانول 70 ٪ وأدوات تعقيم لجراحة العقيم. تغطية التشغيل السطح مع خلع الملابس النظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع كوكتيل الفنتانيل (الفنتانيل 0.05 ملغم / كغم ؛ الميدازولام 5 ملغ / كلغ ؛ metatomadin 0.5 ملغ / كلغ) ، تليها جرعة ربع AVERTIN (0.0075 ملغم / لتر) باستخدام IACUC الإجراءات المعتمدة. يمهد للمعالجة الفئران مع المسكنات ، والبوبرينورفين (0.5 ملغ / كلغ) تدار تحت الجلد (SQ). رصد مستوى الطائرة مخدر اختبار رد الفعل الى الذيل / اصبع قرصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوانات في 37.5 درجة مئوية باستخدام بطانية للتدفئة مع ترمومتر المستقيم المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع العينين من الجفاف. عيون هود مع ورقة صغيرة من الورق لحماية العينين من مصدر الضوء أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص ، وإزالة الشعر من مؤخرة الرأس (خلف الأذن) في العينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتبع تنظيف الجزء العلوي من الرأس الحيوان مع التطبيق متتابعة من الايثانول 70 ٪ ، عن طريق فرك betadine betadine والحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق L - قطع خلف الأذنين وعلى طول الجانب إما الأيمن أو الأيسر من خط الوسط (اعتمادا على نصف الكرة الأرضية الذي سيتم تصويره) في العينين. طية الجلد أكثر من موقع ، وبعيدا عن الجراحة. لا تقم بإزالة الجلد حيث سيتم خياطة الجلد التالية للدورة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط غرامة برفق الجلد وحتى بعيدا من اهتماماتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف بعيدا سمحاق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة مع ملقط نظيف أو شفرة المجهرية. استخدام مسحة القطن ، وتطبيق كمية صغيرة من كلوريد الحديديك 10 ٪ في الجمجمة حتى يجف تماما الغشاء سمحاق وضمان أنه قد تم إزالته تماما. من المهم أن الجمجمة جافة تماما لضمان الالتزام السليم من الغراء (انظر 11). باستخدام الملقط أو شفرة المجهرية ، كشط بلطف بعيدا المجففة غشاء السمحاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate حول نافذة التصوير من الواح الصلب غير القابل للصدأ الرأس (انظر الشكل 1) ويلصق لوحة في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهاية باستخدام عصا خشبية من القطن المسحة ، وتطبيق الغراء لطبقات داخل إطار التصوير ، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الصمغ التسريع في النافذة. يمسح بسرعة بعيدا الزائدة التسريع الغراء مع مسحة القطن أو مسح كيم. يجب أن يكون الغراء توطد تماما قبل الحفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ رقيقة الجمجمة في إطار التصوير باستخدام حفر الأسنان الملصقة مع 0.7 مم لدغ الفولاذ المقاوم للصدأ. حفر بديلة مع التطبيق أحيانا عقيمة المالحة 0.9 ٪ لتجنب توليد الكثير من الحرارة على الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة ملم 4X4 نافذة على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة على سطح الجمجمة مع حفر الأسنان. اختبار ركاكة من الجمجمة مع ملقط نهاية حادة. سوف سطح الجمجمة البادئة قليلا مع ضغط لطيف. سمك الجمجمة الأمثل لتصوير ما بين 10 و 30 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الجمجمة هي رقيقة والإطار تنظيفها من كل الحطام والمكان المالحة على الجمجمة. صورة نافذة التصوير مع الكاميرا الرقمية التي شنت على نطاق وتشريح. والتصوير الفوتوغرافي واستخدام الأوعية الدموية في الدماغ تساعد في تحديد مكان وجود موقف لوضع لوحة التصوير لجلسات التصوير لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات إلى تلاعب 2 - الفوتون. ينبغي أن تبقى على الحيوان بطانية للتدفئة (المستقيم مع التحقيق) خلال الدورة التصوير بأكمله. ملاحظة : عندما تكون تحت التخدير ، ودرجة حرارة جسم الحيوان الأساسية سوف تتقلب بشكل كبير في غياب وحدة التدفئة مما أدى إلى أضرار القشرية أو ربما الموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم مجهر ثنائي الفوتون مع ليزر ماي تاي ، وهو 10W مضخة الحالة الصلبة لأقصى قدر من السلطة وأوليمبوس تعديل وحدة مبائر Fluoview. تم تحسين نظام للتصوير الأنسجة العميقة ويتم تثبيت كاشفات الخارجية أقرب إلى الهدف ممكن للسماح للكشف القصوى لمضان من الدماغ. يتم استخدام LUMPlan أوليمبوس الهدف 20X/0.95NA فلوريدا / IR العدسة. وتستخدم المياه المالحة 0.9 ٪ خلال التصوير لغمر الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هذا المجهر ، وتقريب رقمي منخفضة (X1) تحديد منطقة تحتوي على الخلايا العصبية المسماة الزاهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكاميرا الرقمية الملصقة على قطعة المجهر العين ، ويلتقط صورا للمنطقة التصوير. بدلا من ذلك ، يرسم نمط الأوعية الدموية في الدم. هذا أمر ضروري لإعادةأنتقل إلى موقع التصوير نفسه في نقطة زمنية لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المكدس التكبير المنخفض (X20 الهدف ، 512x512 بكسل ، 5 الخطوة ميكرون) من خلال مدى مرئية بالكامل من الدماغ (الذي يمتد عادة ~ 200 ميكرون) مما يبين مدى تشعب شجيري. ملاحظة : سيتم استخدام هذه الصورة التكبير المنخفضة لتحديد منطقة التصوير في نقاط وقت لاحق كما الأوعية الدموية على حد سواء ، والحفاظ على هيكلها التشعبات في الحيوانات الصغار والكبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير باستخدام برنامج (Fluoview ، V. 5.0 ، FV300) ، وزيادة التكبير الرقمي 8 أضعاف. ضبط إحداثيات س ، ص (PAN إحداثيات) إذا لزم الأمر ، وجمع كومة التكبير العالية التي سوف تظهر مورفولوجيا شجيري مفصلة بما في ذلك مواقع وهيكل العمود الفقري شجيري. تدوين ملاحظات مفصلة عن كل مجموعة مكدس ، أي عموم الإحداثيات ، ومجموعة من جمع وحجم ض خطوة وعدد من الخطوات في الكدسة. وسيتم استخدام هذه الملاحظات عند عودته الى هذا تغصن أو محور عصبي في نقطة زمنية لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير ، وإزالة لوحة فصل رأسه بلطف لوحة من سطح الجمجمة. باستخدام الملقط ، وإزالة أي بقايا الغراء المتبقية على سطح الجمجمة والجمجمة مع مسح المالحة عقيمة 0.9 ٪. خياطة الجلد فوق الجمجمة معا باستخدام # 6 الصفحات خياطة. مسح المنطقة مع الايثانول 70 ٪. لتخفيف الألم أثناء التعافي بعد الجراحة ، وإدارة مسكن البوبرينورفين 0.1 ملغ / كلغ ، SQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الحيوان في القفص نظيفة تحت مصباح الحرارة حتى يستيقظ ، والمحمول. عودة إلى قفص الحيوان الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوان reimage في وقت لاحق نقطة (نقطة وقتنا ويمكن في أي مكان التصوير في الفترة من 2 إلى أيام عدة أشهر بعيدا) ، إزالة أو إعادة فتح غرز الجلد على الرأس باستخدام أساليب العقيم على النحو الوارد أعلاه. استخدام الصور الرقمية من الأوعية الدموية في الدماغ (التي اتخذت في تاريخ الجراحة الأولى) لتحديد موقع التصوير الأصلي. Reaffix headplate الفولاذ المقاوم للصدأ (الخطوات 10-12). استخدام شفرة المجهرية رقيقة بلطف بعيدا أي العظام التي قد تكون إعادة نمت بين نقاط وقت التصوير. إذا لزم الأمر ، رقيقة مع حفر الأسنان. نافذة واضحة التصوير من الحطام وتطبيق قطرة من المياه المالحة عقيمة 0.9 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمل الحيوانات لاثنين من الفوتون المجهر وتحديد مجال التصوير الأصلي. استخدام الصورة الرقمية التي اتخذت خلال الدورة الأولى للتصوير المساعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج وفتح Fluoview الأصلي صورة التكبير منخفضة. لصق ورقة الشفافية على شاشة الكمبيوتر والرسم والاوعية الدموية الرئيسية النمط باستخدام قلم الشفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة الحية ويعيد تنظيم الدم الأوعية الدموية للنمط رسمت على الفيلم الشفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لreimage 8X والتكبير في الهياكل ، وفتح المكدس المطلوب جمعها من الدورة السابقة التصوير. رسم الهيكل (أي محواري ، شجيري ، الدبقية) على فيلم والشفافية ، والملصقة على شاشة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكبير 8X من صورة حية وتعيين الإحداثيات لعموم المعلمات يوم التصوير الأول. اعتمادا على دقة محاذاة موقع التكبير منخفضة ، قد يكون من الضروري أيضا ضبط زاوية من الصورة قليلا. مرة واحدة تم العثور على الهيكل المطلوب ، لتصل المباراة إلى الهيكل الخاص رسمت نمط التكبير عالية. جمع ض المكدس مع حجم خطوة مماثلة ، وعدد من Z - المكدس لتحليل الصور اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 29 و 30 حتى يتم كل الصور عالية التكبير إعادة جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال التصوير ، كرر الخطوات من 22-24. ويمكن تكرار إعادة التصوير بسرعة تصل الى 2 نقطة زمنية منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها الحظيرة وشعبة الطب مختبر الحيوان من جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان ، والاعتماد الكامل من قبل الرابطة لتقييم واعتماد المختبرات رعاية الحيوان ، الدولية (AAALAC) وامتثالا لدولة القانون ، القانون الفيدرالي ، وسياسة المعاهد الوطنية للصحة. </li></ol> ممثل النتائج في GFP - M معربا عن الفئران ، يمكن أن مجموعة فرعية من طبقة الخلايا الهرمية 5 والعمليات المقابلة شجيري يمكن بسهولة تصور باستخدام 2 الفوتون المجهري مسح الليزر (2PLSM) 1. تظاهر هنا لدينا إعداد ضعفت - الجمجمة التي ضعفت الجمجمة حول موقع التصوير المطلوب ل10-30 ميكرومتر ~. بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، علينا وضع تصور واضح والتشعبات القشرية العمود الفقري في القشرة البصرية سليمة للتحليل حاد أو مزمن (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. لوحة مخصصة الرأس والقاعدة : (أ) أعلى عرض مخصص رأس وقدم لوحة الأساسية المستخدمة لإعداد جراحة ضعفت - الجمجمة. (ب) عرض الجانب العرف من صنع لوحة الرأس والقاعدة. (C ، D) وصورة تخطيطية تفصيلية لوحة الرأس. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 2. ممثل عن النتائج التالية 2PLSM رقيقة إعداد الجمجمة (A) الانشعابيات المصورة في الجسم الحي في القشرة البصرية للماوس GFP - M المعدلة وراثيا باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. الصورة هي صورة واحدة من الإسقاط حصل كل من 5 ميكرون الحنون إلى عمق النهائي من 175 ميكرون. محاصر في المنطقة ويمثل المنطقة في تضخيم (B) و (C) التقط في اليوم 0 (D0) وبعد ذلك بأربعة أيام (D4). خسر (D ، E) التكبير العالي فرع شجيري محاصر في وباء وجيم يتظاهرون أشواك مستقرة (رؤوس السهم الأبيض) ، والعمود الفقري التراجع / (رؤساء السهم الأحمر) ، والعمود الفقري جديدة (رؤساء السهم الأخضر). أشرطة النطاق = 200 ميكرومتر ألف وباء وجيم 20 ميكرون ، D ، E. 5 ميكرون.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التصوير المزمنة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري أصبحت تقنية شعبية متزايدة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثار خلال اللدونة 2-5. هنا علينا أن نظهر استعدادا ضعفت - الجمجمة لمتابعة العمود الفقري شجيري التي تم تحديدها في مخ الفأر سليمة في أيام التصوير المختلفة. في ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

المجراة في التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (2PLSM) يسمح لدراسة الخلايا الحية وعمليات الخلايا العصبية في الدماغ سليمة. التقنية المقدمة هنا يسمح التصوير من نفس المنطقة من الدماغ في الوقت عدة نقاط (التصوير المزمنة) مع قرار السماح للالمجهرية تتبع في العمود الفقري شجيري التي هي هياكل الصغيرة التي تمثل الغالبية العظمى من المواقع مثير بعد المشبكي في الجهاز العصبي المركزي. القدرة على حل بوضوح الهياكل القشرية غرامة على نقاط عدة مرات العديد من المزايا ، وتحديدا في دراسة الدماغ في اللدونة التي تغيرات شكلية في نقاط الاشتباك العصبي ، وإعادة تشكيل الدوائر قد يساعد في تفسير الآليات الكامنة. في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للمزمنة في الجسم الحي من تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة. إعداد ضعفت - الجمجمة هو نهج مينيملي ، الذي يتجنب احتمال حدوث تلف و / أو قشرة الجافية ، وبالتالي تقليل ظهور رد فعل للالتهابات. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، فمن الممكن لرصد التغيرات في الخصائص بوضوح شجيري العمود الفقري في الدماغ سليمة على مدى فترة طويلة من الزمن.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للالمزمنة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة.

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Rochester. في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للالمزمنة في الجسم الحي تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة.

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

التصوير الوظيفي للسمعي اللحاء في القطط الكبار باستخدام الحقل عالي الرنين المغناطيسي الوظيفي

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

قياس التوصيل في البصرية المسار الابتدائي في المهق الإنسان عن طريق التصوير إنتشار العضلة الشادة وTractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

إعداد أقطاب تحفيز الأعصاب الطرفية للزرع المزمن في الفئران

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...