Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Burroughs Prémio Carreira em Ciências Biomédicas (AKM), The Whitehall Research Foundation Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), e um NEI financiado, treinamento de visão Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Para visualizar os neurônios no cérebro intacto utilizando dois fótons de microscopia, uma preparação, onde os neurônios são marcados com marcadores fluorescentes é utilizado. Nos experimentos apresentados aqui usamos o GFP-M linha camundongo transgênico que rotula camada 5 células piramidais 1. Camada 5 células piramidais projeto processos dendríticos em camadas superficial, permitindo a visualização dos dendritos e espinhas dendríticas até uma profundidade de 300 mm abaixo do nível da pia. Uma abordagem alternativa é a células etiqueta usando marcadores virais (ver Lowery et al., Submetidos a JOVE). </li><li> Esterilizar o espaço de trabalho usando etanol 70% e as ferramentas de autoclave para a cirurgia asséptica. Cobrir operacional superfície com curativo limpo. </li><li> Anestesiar ratos com um cocktail (fentanil 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) Fentanyl seguida de uma dose trimestre de Avertin (0,0075 mg / ml) usando IACUC procedimentos aprovados. Pré-tratamento camundongos com o analgésico, a buprenorfina (0,5 mg / kg) administrado por via subcutânea (SQ). Monitorar o nível de plano anestésico por reação de teste à cauda / tep pinch. </li><li> Manter animais em 37,5 ° C utilizando manta de aquecimento com termômetro retal em anexo. </li><li> Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar que os olhos sequem. Olhos capa com pequena folha de papel para proteger os olhos da fonte de luz durante a cirurgia. </li><li> Com uma tesoura, remover os pêlos da parte de trás da cabeça (atrás das orelhas) para os olhos. </li><li> Limpe a parte superior da cabeça do animal com a aplicação seqüencial de álcool 70%, seguido pelo matagal betadine e solução de betadine. </li><li> Faça uma incisão L cut-atrás das orelhas e ao longo de cada lado a direita ou esquerda da linha média (dependendo de qual hemisfério será fotografado) para os olhos. Dobre a pele durante e fora do local da cirurgia. Não retire a pele como a pele será suturada após a sessão de imagens. </li><li> Utilizando uma pinça fina puxe a pele para cima e longe de sua área de interesse. </li><li> Delicadamente raspar o periósteo da área exposta do crânio com uma pinça limpa ou lâmina de microcirurgia. Usando cotonete, aplique uma pequena quantidade de 10% de cloreto férrico ao crânio para secar completamente a membrana periósteo e garantir que ele tenha sido completamente removido. É importante que o crânio está completamente seca para garantir aderência adequada da cola (ver 11). Utilizando uma pinça ou lâmina de microcirurgia, delicadamente raspar membrana periósteo secas. </li><li> Aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato em torno da janela de imagem da placa de aço inoxidável cabeça (ver Figura 1) e apor a placa para o crânio. </li><li> Usando o final de uma vara de madeira de algodão do cotonete, aplique cola para costuras dentro da janela de imagem; certificando-se de preencher todas as lacunas entre a placa de imagem e curvatura do crânio. </li><li> Coloque uma gota de cola acelerador para a janela. Rapidamente enxugará acelerador excesso de cola com um cotonete ou kim wipe. A cola deve estar completamente solidificado antes da perfuração. </li><li> Começam a diluir o crânio na janela de imagem usando uma broca de dentista afixada com um 0,7 milímetros de aço inoxidável da rebarba. Perfuração alternam com aplicação ocasional de 0,9% estéril para evitar a geração de muito calor no crânio. </li><li> Fina uma janela de 4x4 mm no crânio usando pequenos acidentes vasculares cerebrais em toda a superfície do crânio com a broca de dentista. Testar a magreza do crânio, com fórceps fim brusco. A superfície do crânio vai travessão ligeiramente com uma leve pressão. A espessura do crânio ideal para geração de imagens é entre 10 e 30 mm. </li><li> Quando o crânio é fina e limpa a janela de todos os detritos, coloque soro fisiológico no crânio. Fotografia da janela de imagem com uma câmera digital acoplada a um escopo de dissecação. Fotografia e uso da vasculatura cerebral irá ajudar na localização da posição de colocar a placa de imagem para as sessões de imagem subseqüentes. </li><li> Transportar o animal para a plataforma 2-fótons. O animal deve permanecer sobre o cobertor de aquecimento (com sonda retal) durante a sessão de imagens completo. Nota: enquanto estiver sob sedação, a temperatura corporal do animal núcleo irá variar enormemente na ausência de uma unidade de aquecimento, resultando em danos cortical ou possivelmente a morte. </li><li> Um microscópio de dois fótons com um Tai Mai laser, uma bomba de estado sólido para 10W de potência máxima e um modificado Olympus FluoView unidade confocal é usado. O sistema é otimizado para imagens de tecidos profundos e detectores externos estão instalados o mais próximo do objetivo possível para permitir a detecção de fluorescência máxima a partir do cérebro. Uma Olympus LUMPlan fl / IR lente objetiva 20X/0.95NA é usado. Salina 0,9% é usado durante o exame para submersão objetivo. </li><li> Usando este microscópio, e zoom digital de baixo (x1) identificar uma área que contém neurônios brilhantemente rotulados. </li><li> Usando uma câmera digital aposta no ocular do microscópio, tirar uma fotografia da área de imagem. Alternativamente, esboçar o padrão de vascularização sanguínea. Isso é necessário para rese voltam para a localização de imagens mesmo em um ponto posteriormente. </li><li> Obter uma pilha de baixa ampliação (x20 objetivo, pixel 512x512; 5 passos mm) através de toda a extensão visível do cérebro (geralmente medindo ~ 200 mm) que mostram a extensão de ramificação dendrítica. Nota: esta imagem baixa ampliação será usado para localizar a área de imagem em momentos subseqüentes como vasos de sangue e dendritos manter sua estrutura em animais jovens e adultos. </li><li> Usando o software de imagem (FluoView, v. 5.0, FV300), aumento ampliação digital de 8 vezes. Ajustar as coordenadas X, Y (pan coordenadas) se necessário e recolher uma pilha alta ampliação que irá mostrar morfologia dendrítica detalhadas, incluindo a localização e estrutura das espinhas dendríticas. Tomar notas detalhadas sobre cada coleção pilha, ou seja, pan coordenadas, o intervalo de coleta, o tamanho z-passo e o número de passos na sua pilha. Essas notas serão utilizados quando voltar a este dendrite ou axônio em um ponto posteriormente. </li><li> Seguinte imagem, retire a placa de cabeça suavemente separando placa da superfície do crânio. Utilizando uma pinça, remova qualquer cola residual restante no crânio e limpe a superfície do crânio, com 0,9% salina estéril. Sutura da pele sobre o crânio em conjunto, utilizando fio de sutura # 6. Limpe área com álcool 70%. Para aliviar a dor durante a recuperação pós-operatória, administrar 0,1 analgésico Buprenorfina mg / kg, SQ. </li><li> Coloque animal em gaiola limpa sob uma lâmpada de calor até que acorda e é móvel. Retorno animal para gaiola original. </li><li> Para recriar animais em um ponto mais tarde (tempo os nossos pontos de imagem pode estar em qualquer lugar de 2 dias a muitos meses de intervalo), remover pontos ou reabrir a pele na cabeça, usando métodos de assepsia como descrito acima. Use a imagem digital do cérebro vascular (tomadas na data da primeira cirurgia) para localizar o local de imagem original. Reafixar aço inoxidável headplate (passos 10-12). Use uma lâmina fina de microcirurgia para suavemente afastado qualquer osso que poderia ter re-grown entre os pontos de tempo de imagem. Se necessário, magro, com broca de dentista. Janela de imagem livre de detritos e aplicar uma queda de 0,9% salina estéril. </li><li> Transportar animais para microscópio de dois fotões e localizar campo de imagem original. Use a fotografia digitais tiradas durante a sessão primeira imagem para obter assistência. </li><li> Abra o programa FluoView e abrir a imagem ampliação original baixa. Juntar uma folha de transparência para a tela do computador e esboçar o padrão navio grande de sangue usando uma caneta de transparência. </li><li> Abra a imagem ao vivo e realinhar a vasculatura de sangue para o padrão esboçado no filme transparência. </li><li> A nova imagem do zoom 8x em estruturas, abrir a pilha desejada coletados a partir da sessão de imagem anterior. Esboço da estrutura (ie axonal, dendríticas, glial) em um filme de transparência, aposta no ecrã do computador. </li><li> Zoom em 8x da imagem ao vivo e definir o pan coordenadas para os parâmetros de imagem primeiro dia. Dependendo da precisão de alinhar a localização de baixa ampliação, pode ser necessário também ajustar o ângulo da imagem ligeiramente. Uma vez que a estrutura desejada, igualar-se a estrutura para o seu padrão de ampliação esboçou alta. Recolher o z-stack com o tamanho do passo idêntico e número de z-stack imagens para análise posterior. </li><li> Repita os passos 29 e 30 até todas as imagens de alta ampliação são recolhidas. </li><li> Quando imagem é completo, repita os passos 22-24. Re-imagem pode ser repetido em até 2 pontos no tempo separados. </li><li> Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Divisão de Biotério e Laboratório de Medicina Animal da Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia, na acreditação plena pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care, internacional (AAALAC) e estão em conformidade com a lei estadual, lei federal e da política NIH. </li></ol> Resultados representante Em GFP-M camundongos expressando, um subconjunto de células piramidais da camada 5 e correspondentes processos dendríticos podem ser facilmente visualizadas usando dois-fotão microscopia de varredura a laser (2PLSM) 1. Aqui nós demonstramos uma preparação diluída crânio-em que o crânio sobre a localização de imagem desejada é diluído em ~ 1-30 mM. Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu visualizar claramente dendritos corticais e espinhas no córtex intacto visual para análise aguda ou crônica (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cabeça personalizado e placa de base. (A) Vista de cima da cabeça feitos sob encomenda e placa de base utilizado para desbaste crânio-preparação da cirurgia. (B) Vista lateral do feito por cabeça e placa de base. (C, D) esquemático detalhado e imagem da placa de cabeça. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. Resultados representativos da 2PLSM seguintes preparação crânio fino. (A) Dendrites imaged in vivo no córtex visual de um rato GFP-M transgênicos utilizando dois fótons de microscopia. Imagem é uma projecção de imagem única obtidas a cada 5 mM da pia a uma profundidade final de 175 mM. A área de box em A representa a região ampliada em (B) e (C) com imagens no dia 0 (D0) e quatro dias depois (D4). (D, E) Maior aumento do ramo dendríticas encaixotado em B e C demonstrando espinhas estável (cabeças de seta branca), perdeu as espinhas / retracção (cabeças de seta vermelha) e espinhas novo (cabeças de seta verde). Barra de escala = 200 mM A., B, C. 20 M, D, E. 5 mm.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Imagem crônica utilizando dois fótons de microscopia está se tornando uma técnica cada vez mais popular para estudar alterações morfológicas desencadeadas durante 2-5 plasticidade. Aqui nós demonstramos uma preparação diluída crânio-a seguir identificados espinhas dendríticas no cérebro do rato intacta nos dias de imagens diferentes. Neste protocolo, o crânio é deixada intacta, causando danos mínimos para o córtex, resultando em níveis muito baixos de neuroinflamação que podem alterar a f...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

In vivo de imagens utilizando dois fótons microscopia de varredura a laser (2PLSM) permite o estudo de células vivas e processos neuronais no cérebro intacto. A técnica apresentada aqui permite que a imagem da mesma área do cérebro em momentos diversos (imagem crônica) com resolução microscópica permitindo o rastreamento de espinhas dendríticas, que são as pequenas estruturas que representam a maioria dos pós-sináptica excitatória locais no sistema nervoso central. A capacidade de resolver claramente multa estruturas cortical sobre vários intervalos de tempo tem muitas vantagens, especificamente no estudo da plasticidade do cérebro em que as alterações morfológicas nas sinapses e remodelação do circuito pode ajudar a explicar os mecanismos subjacentes. Neste material de vídeo e suplementares, mostramos um protocolo para a crônica in vivo de imagens do cérebro intacto utilizando uma preparação diluída crânio. A preparação diluída crânio-se de uma abordagem minimamente invasiva, o que evita possíveis danos à dura e / ou córtex, reduzindo assim o aparecimento de uma resposta inflamatória. Quando este protocolo é realizado corretamente, é possível monitorar claramente mudanças nas características espinha dendrítica no cérebro intacto por um período prolongado de tempo.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a crônica<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem do cérebro intacto utilizando uma preparação diluída crânio.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

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Research

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Neuroscience

13.7K visualizações.  University of Rochester. Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a crônica In vivo Imagem do cérebro intacto utilizando uma preparação diluída crânio.

Vídeo: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

Medição Conectividade no Visual principal via de albinismo humano utilizando tensor de difusão e tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Preparação de Eletrodos de Estimulação Nervosa Periférica para Implantação Crônica em Ratos

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...