وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مركز أورام الدماغ هيرميلين، مستشفى هنري فورد.

1. تعليق خلية واحدة من عينة الورم الأرومي الدبقي الجراحي الطازج لثقافة الغلاف العصبي
<ol><li>مع موافقة خطية من المرضى ووفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وجمع عينات الورم لثقافة الخلية مباشرة بعد جراحة استئصال الورم الدبقي عالية الجودة.</li>
	<li>تأكيد تشخيص عينة الورم حسب علم الأنسجة. نقل العينة فورا من غرفة العمليات إلى غطاء زراعة الأنسجة تدفق صفح، لمعالجة في غضون 1 ساعة من الجراحة. ملاحظة: بالنسبة للجراحات في موقع بعيد، اقطع عينة الورم إلى أجزاء أصغر ووضعها في أنبوب يحتوي على DMEM/F12 (حافظ على الثلج). يمكن معالجة الورم بعد عدة ساعات من الجراحة.</li>
	<li>بدءا من 200-500 ملغ من الأنسجة (الأمثل)، فرم عينة الورم باستخدام شفرة مشرط، ونقل إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل DMEM/F12 المتوسطة الخالية من المصل. مزيج عن طريق عكس عدة مرات، والسماح للورم قطع الرواسب عن طريق الجاذبية، وإزالة المتوسطة، وكرر حسب الضرورة.</li>
	<li>إعداد محلول انزيمي انسداد الأنسجة ووقف الحل الطازجة.<ol>
<li>محلول تفكك الأنسجة الأنزيمية: 5 مل 0.05٪ تريبسين-EDTA، 2.5 مل محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم، 2.5 مل كولاجيناز IV محلول الأسهم (2000 U/ml في HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم).</li>
		<li>وقف الحل: 5 مل حل مثبط تريبسين, 5 مل DMEM/F12, 2 ميكرولتر من 5,000 U/ml DNAse I (المحرز في HBSS الكالسيوم والمغنيسيوم خالية).</li>
	</ol></li>
	<li>إزالة المتوسطة وإضافة محلول تفكك الأنسجة الأنزيمية لعينة الورم المفروم، وذلك باستخدام 2 مل لكل 0.5 غرام من الأنسجة. مزيج بلطف عن طريق عكس.</li>
	<li>احتضان الأنسجة في المحلول عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة تحت الدوران لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>Triturate مع ماصة 2 مل ووقف الهضم أو العودة إلى الحاضنة لاحتضان آخر 15-30 دقيقة اعتمادا على مستوى الهضم.</li>
	<li>وقف الهضم عن طريق إضافة 2 مجلدات من وقف الحل وتريتورات ميكانيكيا مع ماصة المصلية 5 مل.</li>
	<li>تصفية المواد غير المهضومة من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر. بيليه الخلايا في 800 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها غسل 3x في 10 مل DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspend بيليه الخلية النهائية في 5 مل DMEM/F12.</li>
	<li>طبقة ببطء تعليق الخلية أكثر من 5 مل من Lympholyte-M والكريهة في 1,300 x g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل طبقة واجهة تحتوي على الخلايا النووية إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من DMEM/F12.</li>
	<li>بيليه الخلايا في 800 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسيل مع DMEM/F12 2x أكثر.</li>
	<li>Cryopreserve الخلايا الناتجة واحدة لمزيد من الاستخدام عن طريق إعادة تعليق بيليه في الانتعاش الخلية تجميد المتوسطة، aliquoting في cryovials، تجميد بطيء، وتخزينها في النيتروجين السائل.</li>
	<li>إلى الثقافة، وإعادة إنفاق الخلايا في Neurosphere المتوسطة تكملها عوامل النمو (NMGF)، ولوحة في كثافة منخفضة نسبيا (<1 × 105 خلايا / مل) في قارورة زراعة الأنسجة T25 العادية في ظل الظروف القياسية، 5٪ CO2،37 درجة مئوية، حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة (الشكل 1A).<ol>
<li>إعداد NMGF باستخدام الوصفة التالية<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">ل500 مل من DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">حل المخزون</td>
					<td>حجم</td>
					<td>التركيز النهائي</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">N2 الملحق (10x)</td>
					<td>5 مل</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 ملغم/مل محلول مخزون BSA</td>
					<td>1 مل</td>
					<td>0.5 ملغم/مل</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 ملغم/مل كاشف جنتامايسين</td>
					<td>1.25 مل</td>
					<td>25 ميكروغرام/مل</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x مضاد حيوي / مضاد لليميكوتيك</td>
					<td>2.5 مل</td>
					<td>0.5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 ملغم/مل bFGF</td>
					<td>0.1 مل</td>
					<td>20 نانوغرام/مل</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 ملغم/مل من EGF</td>
					<td>0.1 مل</td>
					<td>20 نانوغرام/مل</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>نقل الخلايا العصبية التي تشكل أكثر من 1-3 أسابيع (الشكل 1B-E) إلى قوارير جديدة، لفصل من الخلايا المرفقة والحطام. إجراء تغييرات جزئية في الوسائط كل 3-4 أيام. ملاحظة: إذا فصل الورم xenograft تقويم العظام باستخدام البروتوكول أعلاه، يمكن حذف الخطوات 1.11-1.13.</li>
</ol>2. جليوبلاستوما Neurosphere الثقافة الصيانة وتطبيقات المصب
<ol><li>
التفكك: مراقبة الثقافات العصبية وإجراء تغييرات متوسطة جزئية كل 3-4 أيام. عندما تصل معظم الخلايا العصبية المتعددة في القارورة إلى قطر 100 ميكرومتر ، ينقسم إلى تعليق خلية واحدة:<ol>
<li>نقل المتوسطة التي تحتوي على الأعصاب إلى أنبوب 15 مل، والجاذبية الرواسب neurospheres لحوالي 5 دقائق، وإزالة المتوسطة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 10 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية DPBS.</li>
		<li>مزيج واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والخلايا الرواسب عن طريق الجاذبية.</li>
		<li>إزالة 7-8 مل من DPBS ثم ينفصم الأعصاب ميكانيكيا مع ماصة المصلية prewetted.</li>
		<li>بيليه الخلايا المفككة في 800 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Resuspend الخلايا المفككة (الخطوة 2.1.) في NMGF وتقسيمها إلى العدد اللازم من القوارير (1:3) ، واحتضان في ظل الظروف القياسية. سوف تتشكل الخلايا العصبية الثانوية، وينبغي فصلها في وقت لاحق لتشكيل المجالات الثالثية.</li>
	<li>
تقييم التجديد الذاتي على المدى الطويل:كرر إجراء الانفصال حتى تحقق ثقافة الغلاف العصبي ما لا يقل عن 10 مقاطع ، أي ما يعادل شهرين على الأقل في الثقافة.</li>
	<li>
تجميد: للحفاظ على التبريد في neurospheres، فصل الأعصاب (الخطوة 2.1.) وإعادة إنفاق بيليه الخلية في الانتعاش الخلية تجميد المتوسطة، aliquot في cryovials، تجميد بطيء، وتخزينها في النيتروجين السائل.<ol>
<li>زراعة خلايا الغلاف العصبي من مخزون مجمد: إذابة الخلايا عند 37 درجة مئوية ونقلها على الفور إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 10 مل DMEM/F12. خلط أنبوب بلطف ثم تدور الخلايا في 800 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. غسل بيليه الخلية مرة أخرى وإعادة إنفاق الخلايا في NMGF ونقلها إلى قارورة زراعة الأنسجة T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تعليق الخلية لزرع داخل الجمجمة في الماوس منقوص المناعة:<ol>
<li>فصل الخلايا العصبية (الخطوة 2.1.) وإعادة إنفاق بيليه الخلية في DPBS خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم والاستبعاد الأزرق تريبان.</li>
		<li>حساب عدد الخلايا اللازمة لزرع، وعادة 3 × 105 خلايا / الماوس، ونقل العدد المطلوب من الخلايا في قارورة، والكريه الخلايا في 1000 × ز.</li>
		<li>إعادة تشغيل بيليه الخلية في حجم مناسب لزرع (5 ميكرولتر / الماوس) عن طريق التنصت بلطف على أنبوب الطرد الدقيق. وضع تعليق الخلية على الجليد واستخدامها في غضون 2 ساعة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. البروتوكول البديل لزراعة الأورام الخلايا الأرومية (للحالات التي تفشل فيها ثقافة الغلاف العصبي)
<ol><li>تكملة المتوسط NMGF مع مصل البقر الجنين إلى تركيز النهائي من 2٪ FBS / NMGF.</li>
	<li>
بدءا من الخلايا في الثقافة NMGF: حصاد خلايا قابلة للحياة من قارورة NMGF (الشكل 1F)، resuspend في 2٪ FBS / NMGF ولوحة في كثافة منخفضة نسبيا (<1 × 105 خلايا / مل) في قارورة زراعة الأنسجة T25 العادية، والثقافة في ظل الظروف القياسية، 5٪ CO2، 37 درجة مئوية، حاضنة ثقافة الأنسجة الرطبة (الشكل 1G).</li>
	<li>
بدءا من الخلايا المجمدة أبدا المستزرعة (الخطوة 1.14.): إذابة الخلايا، وغسل في المتوسط الخالي من المصل ولوحة في 2٪ FBS / NMGF والثقافة كما هو موضح في الخطوة 3.2. زراعة في NMGF لمدة 3 أيام قبل نقل خلايا قابلة للحياة إلى 2٪ FBS / NMGF هو بديل للاختيار المسبق بعيدا الخلايا المتمايزة.</li>
</ol>4. التحليل المورفولوجي والجزيئي للغلاف العصبي بواسطة الكيمياء المناعية
<ol><li>ثقافة الأعصاب حتى معظم كرويدات متعددة الخلايا العائمة تصل إلى قطر 100 ميكرومتر.</li>
	<li>إزالة قوارير الثقافة من الحاضنة وعلى الفور بيليه neurospheres، وإزالة المتوسطة وإضافة 10 مل من DPBS دون إزعاج بيليه. إزالة DPBS، resuspend في 10٪ محايدة العازلة الفورماتين واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بيليه كرويدات، ريسوسبند في الإيثانول 30٪ واحتضان لمدة 30-45 دقيقة.</li>
	<li>استبدال الإيثانول 30٪ مع الإيثانول 50٪، واحتضان لمدة 15 دقيقة واستبدالها بالإيثانول الطازجة 50٪، واحتضان 30 دقيقة أخرى.</li>
	<li>كرر (الخطوة 4.4.) مع الإيثانول 70٪.</li>
	<li>استبدال مع 95٪ الإيثانول تغييرين 10-20 دقيقة لكل منهما، وكرر مع الإيثانول المطلق حتى كرويدات بيضاء زاهية ومكثفة.</li>
	<li>جعل مخروط ورقة تصفية صغيرة من ورق العدسة ووضعه في قمع صغير في كوب. الرطب ورقة العدسة مع الكحول المطلق.</li>
	<li>تخفيف بيليه قليلا مع الإيثانول الطازجة 100٪، صب قبالة الإيثانول الزائد وصب كرويدات من خلال مخروط ورقة العدسة، والتأكد من أنها تذهب إلى غيض من المخروط. شطف أنبوب مع الإيثانول المطلق إضافية وصب أي كرويدات المتبقية من خلال مخروط ورقة العدسة.</li>
	<li>إزالة مخروط الورق من القمع وتحريك بعناية كرويدات في الجزء السفلي من المخروط. أضعاف ورقة في مربع وتأكد من أن تكون مغلقة بشكل آمن كما كرويدات ممكن.</li>
	<li>نقل الخلايا العصبية المعبأة إلى كاسيت ونقلها إلى معالج الأنسجة التلقائي.</li>
	<li>برمجة معالج الأنسجة التلقائي على النحو التالي: الإيثانول المطلق، 10 دقيقة، الزيلين، 15 دقيقة (2x)، البارافين، 10 دقيقة (4x).</li>
	<li>إزالة كاسيت من المعالج ووضعه على الجزء ساخنة من نظام تضمين البارافين . تأكد من أن السطح بأكمله خال من الشظايا أو الغبار أو الحطام الآخر وشفط جميع البارافين من الآبار الدافئة. دافئة نظيفة البارافين ملقط الحرة وإضافة كمية صغيرة من البارافين إلى قالب قاعدة ساخنة.</li>
	<li>افتح الكاسيت وأزل الحزمة وضعه على الجزء المسخن من نظام التضمين. افتح مخروط الورق بعناية حتى تظهر الكرويات. جمع أكبر قدر ممكن من المواد مع ملقط prewarmed ونقلها إلى البارافين السائل في العفن قاعدة.</li>
	<li>كرر كما هو مطلوب لاسترداد أكبر عدد ممكن من كرويدات. كشط بلطف ورقة الأنسجة مع شفرة حلاقة نظيفة prewarmed التي تم مسحها مع الإيثانول لجمع أي كرويات المتبقية دون الحصول على أي ورقة في الكتلة.</li>
	<li>تفريق بعناية أي كتل كروية مع ملقط دافئ. نقل كرويدات بعيدا عن زوايا في طبقة مركزية موحدة. نقل العفن قاعدة إلى منطقة التبريد لتأمين كرويدات في مكان، إضافة كاسيت، وملء ببطء مع البارافين، والبرد جيدا.</li>
	<li>يمكن استخدام كتلة البارافين العصبي للقسم العادي والكيمياء المناعية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro.">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas.">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li><li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li><li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo.">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma.">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li><li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria.">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li><li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours.">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype.">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li><li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

إن فصام الخلايا السرطانية الأنزيمية السليم هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. يجب أن يتم فرم الأنسجة قبل فترة وجيزة من الحضانة في محلول فصيل الخلية عند 37 درجة مئوية تحت الدوران ، لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، عندما يجب أن يكون النسيج متهاتة ميكانيكيا ويتم التحقق من تمديد التفكك. اعتمادا على درجة تماسك الأنسجة، يمكن تمديد الحضانة لمدة إضافية 15-30 دقيقة، حسب الحاجة لإكمال الانفصال إلى خلايا واحدة. لا ينصح باحتضان محلول الانفصال لأكثر من ساعة واحدة بسبب انخفاض صلاحية الخلية. على الرغم من أن الكمية المثلى من الأنسجة البداية هي 200-500 ملغ، وقد أدى هذا البروتوكول إلى الثقافات العصبية الناجحة من أقل من 50 ملغ من أنسجة الورم.
NMGF الخالية من المصل هي وسيلة انتقائية ، ونسبة مئوية من الخلايا البلاستيكية الجديدة التي تضم الجزء الأكبر من الورم ، وكذلك الخلايا المضيفة ، لن تبقى على قيد الحياة ، في حين أن البعض الآخر سيلتصق بقارورة الأنسجة المعالجة بعد الطلاء. ومن الأهمية بمكان أن يتم نقل الخلايا العصبية التي ستشكل أكثر من 1-3 أسابيع(الشكل 1B-E)إلى قوارير جديدة، لفصلها عن الخلايا السرطانية والحطام المتمايز.
يمكن أن تكون خلايا GBM منسدة بشكل أنزيمي ومثقفة أبدا (الخطوة 1.10) كمصدر احتياطي للخلايا للثقافة في وسائل الإعلام البديلة ، في حالة فشل ثقافة الغلاف العصبي. لقد نجحنا في الحصول على ثقافات الغلاف العصبي من هذه المخزونات المجمدة ، وكذلك الخلايا أحادية الطبقة التي تنمو في 2٪ FBS / NMGF.
من الناحية المفاهيمية ، "الخلايا الجذعية السرطانية" هو عمل جار وهذا المجال الناشئ سيستفيد من توضيح إضافي ، لأن الآثار السريرية كبيرة ، خاصة في توليد عدم تجانس الورم ، اللدونة ، ومقاومة العلاج1 9،20. بالإضافة إلى كونها حيوية لتوليد نماذج حيوانية GBM خاصة بالمرضى ، فإن ثقافات الغلاف العصبي ذات قيمة أيضا للدراسات المختبرية مثل التغيير في إشارات الخلايا والتعبير الجيني استجابة لعوامل النمو ونقص الأكسيد والعوامل الدوائية11و21. لقد اخترنا استخدام المقاطع العرضية من الجيوسفيرات العصبية الثابتة والبارافين المضمنة ، والحفاظ على العمارة ثلاثية الأبعاد ، لدراسة التعبير البروتيني والتعديلات اللاحقة للترجمة عن طريق الكيمياء المناعية11، بسبب التعريب شبه الخلوي المتفوق فيما يتعلق بطريقة أكثر شيوعا لوضع العلامات وتصوير الكرة بأكملها.
وقد ثبت أن ليس كل الخلايا داخل neurospheres المستمدة من دماغ الثدييات الكبار هي الخلايا الجذعية22. وبالمثل ، فإن الخلايا العصبية المستزرعة من أورام GBM من المرجح ألا تكون كلونية ، بسبب وجود خلايا سلف سرطان أكثر تمايزا وتجميع ذاتي ، معروف بأنه يحدث في كثافات الخلايا العالية23، وهو ما يعتبر قيدا على هذه الطريقة من قبل البعض. لصالح الإثراء للخلايا الجذعية ذاتية التجديد على المدى الطويل ، بدلا من السلف فقط التي يمكن أن تنمو بشكل عابر كغلاف عصبي22، يتم فصل الغلاف العصبي الأساسي لتكوين الغلاف العصبي الثانوي ، ويتم تمريره لمدة لا تقل عن 10 مقاطع ، أي ما يعادل شهرين تقريبا في الثقافة المستمرة ، وهو مؤشر على إثراء السكان في الخلايا الجذعية22. من خلال تجربتنا ، يمكن أن تستمر ثقافات الغلاف العصبي GBM التي تحقق هذه العلامة في التوسع كغلاف عصبي إلى أجل غير مسمى. درجة الورم مهمة، لأننا حصلنا على ثقافات ناجحة من GBMs وastrocytomas اللاتنسجي، منظمة الصحة العالمية الصف الرابع والثالث، على التوالي، ولكن ليس من الأورام الدبقية من الدرجة الدنيا.
الطريقة الأكثر انتشارا لزراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي، في المتوسط النمو التقليدي تكملها 10٪ FBS، يؤدي إلى اختلاف كبير الجينوم و phenotypic من الأورام الأصلية 4. من ناحية أخرى، الثقافات العصبية هي مصدر مستقر وطويل الأجل للخلايا التي تقدم النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية4. أصبحت طريقة الغلاف العصبي شعبية متزايدة لإثراء CSC في الثقافات على المدى الطويل لنماذج xenograft الماوس orthotopic، على الرغم من عدم نجاحها لجميع عينات astrocytoma عالية الجودة، والذي يمثل الضعف الرئيسي لهذه الطريقة. تجري دراسات لفهم كيف يمكن للخصائص الجزيئية للأورام الأبوية أن تؤثر على تكوين الغلاف العصبي. يتم منح استكشاف طرق بديلة عملية لثقافة الأورام الدبقية عالية الجودة ، تليها التحقق من صحة واسعة النطاق ، نظرا للمزايا الهامة لوجود نماذج GBM محددة للمريض ، ونحن نتقدم إلى عصر الطب الشخصي ، تغذيه إمكانية الوصول إلى معلومات "omics" وزيادة أعداد العلاجات المستهدفة المحتملة.

الورم الأرومي الدبقي (GBM)، وهو ورم فلكي من الدرجة الرابعة من منظمة الصحة العالمية، هو الورم الدماغي الأولي الأكثر انتشارا وعدوانية. يتم اعتماد الأنماط الظاهرية التنموية المتنوعة من قبل الخلايا السرطانية GBM ، بما في ذلك الخلايا التي تظهر خصائص "الخلايا الجذعية السرطانية" (CSC) ، مثل التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية (NSC) ، والتجديد الذاتي على المدى الطويل ، وإمكانية إحداث خلايا أكثر تميزا تعبر عن علامات فلكية وتشكل الجزء الأكبر من الورم1-3. في حين لا تزال هناك حاجة إلى توضيح فيما يتعلق بالهوية الجزيئية CSC والآثار السريرية ، فإن تركيز العمل الحالي ينصب على التعريف التشغيلي ل CSC: التجديد الذاتي على المدى الطويل في المختبر والقدرة على تمييز وإعادة إنتاج الورم الأصلي عند زرع تقويم العظام في القوارض المنافرة المناعية.
وقد تم استزراع خلايا الورم الأرومي الدبقي لعقود في الوسط التقليدي الذي يحتوي على 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) والعديد من الممرات العالية المتاحة تجاريا خطوط خلايا GBM المستزرعة في مصل الأورام هي tumorigenic في القوارض المنافرة المناعية ، ولكن هناك اختلاف كبير في الجينوم والجزيئية من الورم الأصلي4، مما يحد من استخدامها كنماذج ذات صلة سريريا. في الآونة الأخيرة، تم تحديد الخلايا ذات النمط الظاهري الجذعية / السلف استجابة لEGF وbFGF في GBMs2. في وقت لاحق، تم زرع عينات الورم GBM فصلها في المتوسط خالية من المصل3،وضعت أصلا لاختيار وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الثدييات الكبار5. هذه الظروف الثقافية تعوق نمو معظم مجموعات الخلايا السرطانية غير البلاستيكية والأكثر تميزا ، مع تفضيل نمو الخلايا الجذعية والذرية كرويدات عائمة متعددة الخلايا ، أو الخلايا العصبية3، تحاكي سلوك الخلايا الجذعية العصبية للثدييات البالغة5. مقارنة شاملة جنبا إلى جنب من الخلايا GBM الأولية المستزرعة في إما الوسط العصبي تكملها عوامل النمو (NMGF) أو في المتوسط النمو التقليدية تكملها مع 10٪ FBS، كشفت أن GBM العصبية كانت tumorigenic، قدمت إمكانات التمايز متعدد الخطوط، والحفاظ على النمط الجيني للورم الأصلي، على النقيض من الثقافات FBS 10٪ التي لم تكن tumorigenic في الممرات المنخفضة وتباينت إلى حد كبير من الأورام الأصلية في الممرات المتأخرة4.
عزل CSC من الأورام GBM فصلها عن طريق فرز الخلايا على أساس التعبير عن المفترض CSC علامة CD133 كما اقترح6,7, ولكن المزيد من العمل أشار إلى أن النمط الظاهري CSC لا يرتبط بشكل قاطع مع التعبير عن مثل هذه العلامات8-10, خفض الحماس الأولي لهذه الاستراتيجية, في حين لا تزال علامات جديدة يجري اختبار10. عدم توفر مجموعة من العلامات التي تم التحقق من صحتها لتحديد CSC حتى الآن ، إلى جانب هدف تضخيم هذه الخلايا على نطاق واسع للدراسات ما قبل السريرية ، يجعل استخدام فرز الخلايا غير عملي للثقافات الروتينية المخصبة ب CSC. خلايا GBM التي تختارها القدرة على النمو كما neurospheres في NMGF تعبر دائما علامات الخلايا الجذعية العصبية. لقد لاحظنا أن Sox2 و nestin يتم التعبير عنها في كل مكان في ثقافات الغلاف العصبي ، في حين أن بروتين CD133 موجود في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية GBM (البيانات غير المنشورة والمرجع11).
العديد من المختبرات تسعى الثقافات العصبية من أورام الورم الأرومي الدبقي باستخدام نفس النهج العام للتفكك الأنزيمي وزراعة في المتوسط الخالي من المصل تكملها عوامل النمو3,4,11-14, في حين أبلغ زملاء آخرون محاولات لزراعة الثقافات العصبية على المدى الطويل من عينات GBM دون نجاح . الطريقة العامة للانزيمية الإنزيمية والثقافة العصبية من الأورام الدبقية عالية الجودة المعروضة هنا مماثلة لما تم توضيحه في المنشورات المذكورة أعلاه. لقد قمنا بتحسين البروتوكول بناء على خبرتنا في فصل وزراعة أكثر من 100 عينة GBM. كفاءة الحصول على ثقافات الأعصاب على المدى الطويل من عينات GBM الطازجة تطبيق البروتوكول المعروض هنا هو أكثر من 40٪، على غرار التقارير القليلة التي تظهر كفاءة البيانات3،15، مما يؤدي إلى استكشاف بروتوكولات بديلة مثل زراعة الخلايا باستمرار أو متقطعة في المتوسط خالية من المصل في وجود EGF وbFGF كما monolayers على الأسطح المغلفة بروتين ECM16،17. الثقافات العصبية لا تزال النهج الأكثر صحة وشعبية متزايدة للحفاظ على الخصائص الجزيئية لأورام GBM والإمكانات الورمية3،4،11-14، وبالتالي فإن نهجنا هو محاولة ثقافات الغلاف العصبي أولا ، في حين أن الاختبار المصاحب لطرق بديلة لزراعة خلايا GBM التي تفشل في تشكيل مجالات عصبية ذاتية التجديد على المدى الطويل ( الشكل1) ، لزيادة تمثيل أورام GBM التي يمكن استخدامها في النماذج الحيوانية. هنا نقدم بروتوكولا لزراعة الخلايا العصبية من GBMs. بالنسبة للخلايا التي تفشل في تشكيل الغلاف العصبي ، نظهر تعديلا بسيطا في متوسط النمو ، كأول محاولة زراعة الخلايا السرطانية من الغلاف غير المحيطي التي تشكل GBMs ، مع نتائج واعدة ولا تزال تخضع للتحقق من صحة واسعة النطاق.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

الأورام الأرومية الدبقية، الشكل الأكثر شيوعا وعدوانية من astrocytoma، هي الانكسار للعلاج، وغير متجانسة جزيئيا. القدرة على إنشاء ثقافات الخلايا التي تحافظ على الملف الجينومي للأورام الأبوية ، لاستخدامها في المختبر المحدد للمريض وفي نماذج الجسم الحي ، لديها القدرة على إحداث ثورة في التطور قبل السريري للعلاجات الجديدة للورم الأرومي الدبقي المصممة وفقا للخصائص الجزيئية لكل ورم.
بدءا من أورام astrocytoma عالية الجودة الطازجة المشتتة إلى خلايا واحدة ، نستخدم المقايسة العصبية كطريقة إثراء للخلايا التي تقدم النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية ، والتجديد الذاتي على المدى الطويل في المختبر، والقدرة على تشكيل أورام xenograft orthotopic. وقد سبق اقتراح هذه الطريقة، ويستخدمها الآن العديد من المحققين. استنادا إلى تجربتنا في فصل وزراعة 125 عينة من الورم الأرومي الدبقي ، وصلنا إلى البروتوكول التفصيلي الذي نقدمه هنا ، ومناسب لزراعة الغلاف العصبي الروتيني للخلايا الفلكية عالية الجودة والتوسع على نطاق واسع في الخلايا السرطانية للدراسات ما قبل السريرية. نحن نقدم تقريرا عن كفاءة الثقافات الناجحة على المدى الطويل باستخدام هذا البروتوكول واقتراح بدائل بأسعار معقولة لزراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي المفككة التي تفشل في النمو كغلاف عصبي. كما نقوم بوصف بروتوكول مفصل للحفاظ على العمارة ثلاثية الأبعاد للكيمياء المناعية. ثقافات الخلايا المخصبة في CSCs، قادرة على توليد نماذج xenograft تقويم العظام التي تحافظ على التوقيعات الجزيئية وعدم التجانس من GBMs، أصبحت شعبية متزايدة لدراسة بيولوجيا GBMs وتحسين تصميم الاختبار قبل السريرية من العلاجات المحتملة.

لقد طبقنا البروتوكول المذكور أعلاه على فصام والثقافة 125 عينات الورم الأرومي الدبقي الجراحية الطازجة (الشكل 1)، 88 تشخيص حديثا، و 37 الأورام المتكررة (الجدول 2)، بموافقة المريض المعتمدة وبموجب المبادئ التوجيهية المؤسسية. وكانت كفاءة البروتوكول لإنشاء ثقافات الأعصاب على المدى الطويل 41.6٪، وما شابه ذلك للأورام التي تم تشخيصها حديثا والأورام المتكررة (الجدول 2). بالنسبة لبعض عينات GBM ، تتشكل الخلايا العصبية في الأيام القليلة الأولى(الشكلان 1B و 1C)، بينما بالنسبة للآخرين يلزم وقت زراعة أطول(الشكلان 1D و 1E).
لم تكن كفاءة تكوين الغلاف العصبي تعتمد بشكل حصري على مستوى النخر في الأنسجة ، كما يتضح من نتائج الورم الذي تم تشخيصه حديثا مع كثافة الخلايا العالية (GBM1) والورم المتكرر والنخري (GBM2) المعالج وفقا للبروتوكولين 1 و 2 ، وكلاهما ينتج ثقافات الغلاف العصبي(الشكل 2).
اختبار الإمكانات الورمية لكل ثقافة الغلاف العصبي في الفئران منقوصة المناعة هو التحقق الحاسم من هذا النهج لإثراء CSCs. باستخدام بروتوكول مماثلل18وصفها سابقا ، تم زرع GBM1 و GBM2 neurospheres في أدمغة الفئران منقوصة المناعة ، بموجب المبادئ التوجيهية المؤسسية وIACUC لرعاية الحيوانات. أورام xenograft تقديم الخصائص المورفولوجية من GBMs، مثل غزو في الدماغ parenchyma ونخر (الشكل 2).
تم فصل GBM3(الشكل 1A)ومثقف في الوسط العصبي(الشكلان 1D و 1E)،وفي 2٪ FBS/NMGF (الأرقام 1D، 1G، و 1H). تم فصل خلايا أحادية الطبقة المستزرعة في 2٪ FBS /NMGF وخلايا الغلاف العصبي المستزرعة في NMGF وزرع نفس العدد من الخلايا في الماوس العاري ، وذلك باستخدام نفس الإجراء كما هو الحال في الشكل 2. لم تلاحظ أي اختلافات في البقاء على قيد الحياة، وديناميات نمو الورم، أو مورفولوجيا بين طريقتي الثقافة قبل الزرع(الشكل 3A-C). خصائص نمو الورم لا تتغير حتى آخر مرور اختبارها، P20 للأعصاب، وP10 ل2٪ FBS / NMGF. في حين أن علامات الخلايا الجذعية العصبية، بما في ذلك Sox2، يتم downregulated في معظم خلايا GBM الأولية المستزرعة في 10٪ FBS 3،4،11، NMGF تكملها مع 2٪ FBS يسمح للاحتفاظ التعبير Sox2 (الشكل 3D).
تمت معالجة الخلايا العصبية وفقا للبروتوكول 4، ووصفت مع H &amp؛ E (الشكل 4A)، المضادة لSox2 الأجسام المضادة، والتي تبين توطين النووية (الشكل 4B)،والأجسام المضادة EGFR، خلية غشاء توطين (الشكل 4C). وقد تم تطبيق هذا البروتوكول للوصول إلى التعديلات التي تعتمد على المحفزات في التعبير عن نيستين، GFAP، وعلامة الانتشار Ki6711.
الجدول 2 - الأرباح كفاءة اشتقاق ثقافات الأعصاب ذاتية التجديد على المدى الطويل من GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>علم الأمراض</td>
			<td>ن</td>
			<td>النسبة المئوية للعينات التي تنتج عن الخلايا العصبية ذاتية التجديد على المدى الطويل (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>الورم الأرومي الدبقي - غير معالج، الجراحة الأولى</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>الورم الأرومي الدبقي - متكرر</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 زراعة الخلايا من عينات جراحية جليوبلاستوما الطازجة. تنقسم الأورام الطازجة بشكل أنزيمي إلى خلايا واحدة. ثم يتم طلاء واجهة الخلية النواة من متوسط فصل الكثافة في NMGF. مطلية neurospheres فصل في NMGF، وعادة 1 بعد يوم من الطلاء هناك خلايا ميتة، والحطام، والخلايا المفردة المرفقة، وأحيانا تقسيم الخلايا في تعليق (أ). تكوين العصبية أسرع لبعض الحالات (B, C), وأبطأ بالنسبة للآخرين (D, E). يتم فصل جميع الخلايا العصبية وإعادة طلاءها لمدة 10 مقاطع على الأقل ، وينتج 41.6٪ GBMs عن مجالات عصبية ذاتية التجديد على المدى الطويل. يمكن نقل الخلايا القابلة للحياة التي تفكك GBM التي تفشل في النمو كغلاف عصبي(F)إلى ظروف ثقافية بديلة ، على سبيل المثال 2٪ FBS / NMGF (G ، H). شريط (A), 100 ميكرومتر, ينطبق على جميع الصور. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم الجيل العصبي والفأر التقويمي xenografts من أورام GBM. تم فصل عينة ورم تمثل كثافة الخلايا العالية (GBM1) وورم يحتوي على محتوى عالي (GBM2) وتم استزراع الغلاف العصبي لمدة 10 مقاطع وفقا للبروتوكولين 1 و 2. تم زرع الفئران المناعة مع 3 × 105 خلايا الغلاف العصبي المفككة والتضحية بها عند احتضارها. وكانت أدمغة الفئران الفورمالين ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من تلطيخ H &amp؛ E والكشف عن الكيمياء المناعية من علامات الإنسان، الميتوكوندريا البشرية (hMit) أو فئة التوافق الهستوني الرئيسي I subunit HLA-A (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن نمو الورم مماثلة في الفئران المزروعة داخل الجمجمة مع خلايا GBM3 المستزرعة كما neurospheres في NMGF أو أحادية الطبقات في 2٪ FBS / NMGF. (أ)منحنيات كابلان ماير البقاء على قيد الحياة لGBM3 مثقف إما العصبية في NMGF أو monolayers في 2٪ FBS / NMGF (كلا مرور <10) تظهر أي فرق في البقاء على قيد الحياة (ن = 10، ف = 0.7174، اختبار سجل رتبة). (ب)نمو الورم الذي رصده التصوير الحيوي الحي (BLI) لا يظهر فرقا كبيرا في ديناميكيات نمو الورم بين المجموعتين. (ج)مورفولوجيا الورم لا يمكن تمييزها عن 4 GBM3 xenografts، 2 مثقف في NMGF و 2 مثقف في 2٪ FBS / NMGF. MHC-I وصمة عار كما هو موضح للشخصية 2. مقياس، 600 ميكرومتر. (D) لطخة الغربية تظهر الخلايا الجذعية صانع Sox2 التعبير الاحتفاظ بها في 2٪ FBS / NMGF الثقافات المستخدمة لبدء الأورام xenograft (A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تحليل التعبير البروتيني في أقسام الغلاف العصبي عن طريق الكيمياء المناعية. كانت الثقافات العصبية الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ كما هو موضح في الإجراء 4، وملطخة H &amp؛ E (A)، المضادة لSox2 الأجسام المضادة(B)،والأجسام المضادة للEGFR(C). تم استخدام ركيزة DAB لتصور (B, C). بار، 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry at JoVE.com

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

بروتوكول لنشر العينات الجراحية الورم الدبقي عالية الدرجة المفككة في وسيطة الغلاف العصبي الخالية من المصل لتحديد الخلايا ذات النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية. بالنسبة للعينات التي تفشل في النمو كغلاف عصبي ، يقترح بروتوكول بديل. ويرد وصف تقنية تضمين البارافين للحفاظ على العمارة العصبية ثلاثية الأبعاد للكيمياء المناعية.

تحسين ثقافة خلايا الورم الدبقي عالية الجودة من العينات الجراحية لاستخدامها في النماذج الحيوانية ذات الصلة سريريا والكيمياء المناعية ثلاثية الأبعاد

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K Views.  Henry Ford Hospital. بروتوكول لنشر العينات الجراحية الورم الدبقي عالية الدرجة المفككة في وسيطة الغلاف العصبي الخالية من المصل لتحديد الخلايا ذات النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية. بالنسبة للعينات التي تفشل في النمو كغلاف عصبي ، يقترح بروتوكول بديل. ويرد وصف تقنية تضمين البا...

Video: Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

استخدام نموذج حيواني للتسمم لتقييم العلاجات العشبية رواية

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

عالية التردد التصوير بالموجات فوق الصوتية للماوس عنق الرحم الغدد الليمفاوية

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

استخدام فائقة MRI الميداني في القوارض الصغيرة نماذج من مرض الكلى المتعدد الكيسات ل<em&gt; في فيفو</em&gt; Phenotyping والدواء المراقبة

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

تنفيذ<em&gt; في المختبر</em&gt; المخدرات المقاومة فحوصات: تعظيم إمكانات لكشف آليات المقاومة ذات الصلة سريريا

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

نماذج الجراحية من الجزر المعدي مع الفئران

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

الجلدي إزالة التعصيب الجراحي: هناك طريقة لاختبار شرط لالأعصاب في نماذج الماوس من الأمراض الجلدية

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

نموذج لمحاكاة نقص الأكسجة ذات الصلة سريريا في البشر

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

تقييم خصائص مضادة للالتهابات والتخثر غشائي الخلايا باستخدام الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد والدم كله غير أنتيكواجولاتيد

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...