מחקר זה נתמך על ידי תרומות של ונדרבילט Ingram-Cancer Center תמיכה גרנט (P30 CA068485), המוח ילדות קרן גידול לבין המכון הלאומי לבריאות (NS042205).

1. Micro-דיסקציה של המוח הקטן נושאות גידולים, דיסוציאציה של רקמות ציפוי הגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איחזור של רקמת הגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולובלסטומה עכברים חולים נושאת לעתים קרובות היו המנוון, מוצג hydrocephaly ועל סימפטומים נוירולוגיים טיפוסי, כולל שיתוק האחורי ואי להחזיר יציבה כאשר התהפכה. כדי לאחזר את רקמת הגידול, להרדים עכברים משאיפת פחמן דו חמצני. חשוב לא לבצע את העקירה צוואר הרחם, תהליך שיוצר לחץ על הגולגולת האחורי והוא יכול לסכן את שלמות רקמת הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עריפת ראש מבוצעת מיד לאחר מותו באמצעות מספריים, הסרת שיער רקמת שריר ככל האפשר עבור להדמיה טוב של הגולגולת. נקו את פני השטח של הגולגולת עם Kimwipe ספוגה אתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים בסדר לחתוך פתח לאורך קו האמצע של הגולגולת, ולהסיר רקמה הגולגולת באמצעות פינצטה בסדר, ובנקודה המוח כולו כולל המוח הקטן נושאות גידולים חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד cerebella של מבוגרים בריאים להציג מוגדרים היטב ההמיספרות ו vermis, cerebella של נושאות גידולים בעכברים לעיתים מוגדלת, אמורפי עם משטח חלק וכלי דם בולט. באמצעות שימוש בטכניקות סטריליות, לאחזר את הגידול cerebellar באמצעות פינצטה ומכניסים קר כקרח PBS ללא Mg2 + ו - Ca 2 +. </li></ol> הערה: כל המכשירים הם מעוקרים באתנול 95% לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסוציאציה של רקמת הגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את רקמת הגידול של PBS על Accutase 50% (בדילול מלא PBS) כי הוא על נפח 4 פעמים של רקמת הגידול, לרכך את רקמת עם מספריים בסדר 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות , לאחר מכן הרקמה עובר pipeting חוזרות עם Pipetman 1-מ&quot;ל למשך 3 דקות נוספות. שיטה זו אמורה להניב תערובת של תאים בודדים ו אגרגטים סלולריות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה הסלולר של פי 3 עם PBS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1000 גרם ל גלולה התאים. Resuspend התא גלולה בינוני טרי עצביים תא גזע תרבות צלחת על צלחת Primaria gelatinized 60 מ&quot;מ רקמת תרבות. אנו משתמשים מנות Primaria עבור התקשרות משופרת ב ציפוי הראשון; הקטעים הבאים עשוי להיות מצופה על מנות התרבות קבוע רקמות. </li></ol></li></ol> הערה: סמל תרבות מנות עם 0.1% ג&#39;לטין במשך לפחות 30 דקות. הכן תא טרי גזע עצביים תרבות בינוני המורכב בינוני Neurobasal עם גלוטמין, עט סטרפטוקוקוס, N2, B27, אדם EGF (25 ng / mL) ו FGF בסיסיים (25ng / mL). 2. , העשרה תחזוקה הרחבה של תאים סרטניים על ידי מדולובלסטומה מעברים סידורי בדרך כלל אנחנו מקבלים מושבות רבות לאחר שבוע 1 של ציפוי ראשוני (איור 1). מושבות אלה ניתן הפרידו replated על מנות gelatinized חדש להעשרת אוכלוסיית תאים סרטניים. שינוי ראשון עד בינוני תרבות חדשה, ואז פשוט להשתמש 1-mL Pipetman כדי לנתק באופן מכני מושבות ואחריו pipeting חוזרות ונשנות במשך 4 דקות להניב ההשעיה הסלולר (Accutase ללא צורך). בדוק תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי גושי תאים גדולים כבר ניתק. אז לוותר על ההשעיה תא מנות gelatinized חדש culturing נוספת לעבור הליך זהה קטעים נוספים. תאים סרטניים פנוי, כדוריות הדם ואת סוגי תאים אחרים מוסרים על ידי סדרתי מחדש platings, עוזב את התאים הסרטניים מצורף להתרחב במהירות. שינוי התרבות בינוני ביום השני הבא זריעת הראשונית, וכל יום אחר לאחר מכן. 3. מכתים Immunofluorescent ועל בחינת תאים בתרבית 1. לגדל תאים סרטניים על coverslips זכוכית ב 1 יום, מקום אחד זכוכית coverslip בכל צלחת 6-היטב, ואז להוסיף 0.1% ג&#39;לטין במשך 30 דקות על 37 ° C. Seed כ 2-4X 10 5 תאים סרטניים לכל מ&quot;ל. התאים צריכים לצרף לילה ואמצעי בתאי גזע עצביים השתנה ביום 3. מכתים מתבצעת ביום 4. 2 Immunofluorescent מכתים הסר בינוני התרבות תאים לשטוף פעמיים עם קרים כקרח PBS. תקן את התאים עם טרי מתוצרת PFA 4% במשך 15 דקות. בקצרה לשטוף תאים פעמיים עם PBS ו permeablize טריטון עם 0.3% (ב PBS) במשך 5 דקות. בקצרה לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולחסום עם סרום עיזים 10% במשך 40 דקות. דגירה התאים עם הנוגדנים העיקרית 90 דקות, ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, במשך 5 דקות כל אחד. דגירה התאים עם הנוגדנים משני במשך 60 דקות, ואז לשטוף שלוש פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד. הר coverslips על שקופיות עם 5 מ&quot;ל של מדיום הרכבה מימית ולבצע מיקרוסקופיה confocal. 4. התמיינות של תאים סרטניים הסר nתא eural גזע בינוני בקצרה לשטוף תאים עם PBS פעמיים. הוסף בינוני בידול ביום 1, לשנות בינוני ביום 4 ולקבוע רמת בידול על ידי מכתים immunofluorescence ביום 7. בידול בינוני מורכב DMEM, עט סטרפטוקוקוס ו -10% בסרום שור העובר. 5. נציג תוצאות מורפולוגיה תוצאות לאחר הטיפול Accutase ו pipeting חוזרות עדין, רקמת הגידול צריכה להיות מנותקת בעיקר לתוך אגרגטים הסלולר קטן תאים בודדים. מושבות ניכר רבים ניתן להבחין כבר 5 ימים לאחר ציפוי ראשוני, כפי שמוצג על ידי באיור 1. שגשוג תאים סרטניים ביותר הם לעתים קרובות דו קוטבי עם יחס גרעיני / cytoplasmic גבוהה. תאים אלה נתפסים בדרך כלל מקרין מן אגרגטים הסלולר קטן המחובר אל פני השטח gelatinized. תאים דם, קטן ועגול, מוסרים בדרך כלל על ידי שינויים במדיה עתידיים platings סדרתי. אחרי כמה קטעים, ניתן לראות מפוזרים באופן אחיד, שגשוג תאים סרטניים Ki67 + וזיהום קטנה עם סוגי תאים אחרים (איור 2). הביטוי של סמנים עצביים תא גזע, ניתוח והבחנה משובט לתוך שושלות מרובים כדי לקבוע אם שגשוג התאים שמקורם ניתק cerebellar רקמת הגידול המאפיינים להראות בתאי גזע סרטניים, ביצענו אפיון נוסף של ביטוי סמן תא גזע, ניתוח המשובטים ואת העוצמה בידול. מצאנו כי אלה תאים סרטניים מבודדים לבטא בתאי גזע עצביים סמנים כגון Sox2 ו Nestin (איור 3). כשלקחנו רקמות מן הגידול SmoM2-YFP, כל התאים הסרטניים להביע YFP. בקנה אחד עם מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי cilia העיקרי חשובים לפיתוח של מדולובלסטומה מסלול תלויי ששש 12, SmoM2-YFP ביטוי מקומי היה ברור cilia של Sox2 + תאים סרטניים (איור 3). כאשר מצופה בצפיפות המשובטים של 300 תאים לכל מ&quot;ל של מדיום תרבות, ראינו התרחבות משובטים מתא בודד גידול למושבה ניכר (איור 4). יתר על כן, תאים אלה היו מסוגלים להתמיין לסוגי תאים שונים עצב גליה כאשר בתרבית תחת בעד בידול התנאים (איור 5). <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מורפולוגיה של מושבה שגשוג מאוד לאחר ציפוי הראשון של רקמות מדולובלסטומה ניתק. ככלל, צורות מושבה גדולה בתוך 5 ימים לאחר זריעה ראשונית של רקמת הגידול ניתק, וכן נציג אחד מודגם כאן בשדה בהיר. דו קוטבי, להקרין תאים מאורכים מתוך הצבירה הליבה תא צפוף. הנספחות תאים סרטניים הם קטנים, תאים עגולים דם אדומים, אשר מתרוקנים בהדרגה platings סדרתי. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מורפולוגיה של תאים מדולובלסטומה הוקמה מעבר לשלושה קטעים. תמונה זו מציגה את השדה בהיר מראה טיפוסי של תאים מדולובלסטומה שהוקמו אחרי כמה פסקאות. התאים נשארים לרוב דו קוטבי עם יחס גרעיני / cytoplasmic גבוהה. אנחנו מראים מכתים טובולין acetylated של תאים סרטניים, אשר רובם רכיבה על אופניים, כפי שמוצג על ידי ביטוי Ki67 חזק. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תאים מדולובלסטומה הוקמה להביע סמנים תא גזע עצביים. SmoM2-YFP סימני תאים להביע SMO constitutively פעיל, ולכן הפעילות מסלול ששש. כל התאים של שורות תאים הוקמה מדולובלסטומה הביע YFP, ורובם שיתוף הביעו רמות גבוהות של סמנים שונים עצביים תא גזע, כגון Nestin ו Sox2. מעניין, כאשר ביצענו זיהוי YFP אות עם כוח לייזר מינימלי במהלך מיקרוסקופיה confocal, זיהינו אות YFP מרוכזים cilia של תאים Sox2 +. תצפית זו עקבית עם 12 דיווח לאחרונה כי תיאר את תפקיד חיוני של cilia בפיתוח של מדולובלסטומה מסלול תלויי ששש. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. תאים סרטניים הוקמה עוברים משובטים הרחבה. לאחר ניתוק לתוך ההשעיה תא בודד, תאים סרטניים היו מצופה על 24 היטב צלחת בצפיפות המשובטים של 300 תאים לכל מ&quot;ל של מדיום תרבות. בשנת היטב כל צפינו מושבות מורחבת clonally. זו סדרה של תמונות ממחישות שינויים בשדה בהיר אופייני לאורך תקופה של 10 יום של תרבות. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. התמיינות של תאים מנתח מדולובלסטומה הוקמה. כאשר תאים סרטניים היו משיטת EGF / bFGF המכילה סרום ללא בינוני עד DMEM/10 FBS%, YFP + תאים סרטניים שינו באופן משמעותי את המורפולוגיה שלהם מובחן לתוך תאים מסוגים שונים, including Tuj1 + + או NeuN נוירונים, GFAP + תאים astroglial או CNPase + oligodendrocytes.

<ol>
	<li>Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+From+Molecular+Pathology+to+Therapy.">Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy.</a> Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Neuronal+Precursor+Proliferation+in+the+Cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).</li><li>Wallace, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje-cell-derived+Sonic+hedgehog+regulates+granule+neuron+precursor+cell+proliferation+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum.</a> Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).</li><li>Fan, X., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullablastoma+Stem+Cells.">Medullablastoma Stem Cells.</a> J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).</li><li>Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+Role+for+Hedgehog+Pathway+Activation+in+Desmoplastic+Medulloblastoma+by+Identifying+GLI1+Target+Genes.+International+journal+of+cancer.">Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer.</a> 124 (1), 109-109 (2009).</li><li>O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+anatomic+and+molecularly+targeted+imaging+in+the+diagnosis+and+surveillance+of+embryonal+tumors+of+the+nervous+and+endocrine+systems+in+children.+Review.">Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review.</a> Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).</li><li>Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+Growth+Factor+2+Is+Required+for+Progression+to+Advanced+Medulloblastoma+in+patched1+Heterozygous+Mice.">Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice.</a> Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).</li><li>Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Origins+of+Medulloblastoma+Subtypes.">The Origins of Medulloblastoma Subtypes.</a> Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).</li><li>Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+CD15++Cancer+Stem+Cells+in+Patched-1+Deficient+Mouse+Medulloblastoma.">Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma.</a> Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).</li><li>Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Somatic+Mouse+Model+to+Survey+Tumorigenic+Potential+Applied+to+the+Hedgehog+Pathway.">A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway.</a> Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).</li><li>Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development.">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מתארים דרך יעילה לבודד, להעשיר ולתחזק גזע מדולובלסטומה תאים מרקמת הגידול הראשוני שנמצאו בעכברים עם מוטציה פעיל constitutively הקיפוד איתות. מצאנו כי צעד קריטי בהצלחה בהקמת גידול בריא קו תא גזע הוא הטיפול Accutase שימוש במהלך דיסוציאציה של רקמת הגידול הראשוני. מניסיוננו, כא...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hEGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0311</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0023</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502048</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>B27(-RA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12587010</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Accutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1110501</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1393</td>
<td> 0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030081</td>
<td>2mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primaria dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>087724C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB4343</td>
<td>Mouse, 1:1000</td>
</tr>
<tr>
<td>Nestin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DSHB</td>
<td>rat401</td>
<td>Mouse, 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>YFP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>A11122</td>
<td>Rabbit, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>GFAP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neuromics</td>
<td>CH22102</td>
<td>Chicken, 1:1000</td>
</tr>
<tr>
<td>Tuj1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5076</td>
<td>Mouse, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuN antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB377</td>
<td>Mouse, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>CNPase antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB326</td>
<td>Mouse, 1:1000</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma stem cells

גידולים במוח הוצעו להחזיק אוכלוסייה קטנה של תאי גזע הם שורש tumorigenesis. מבחני Neurosphere אומצו בדרך כלל ללמוד את טבעו של בתאי גזע עצביים, כולל אלו שמקורם ברקמות נורמליות tumorous. עם זאת, כמות ניכרת של התמיינות ומוות התא נפוצים neurospheres תרבותי בשל סביר מצב תת אופטימלי כגון נגישות של כל התאים בתוך אגרגטים בתחום התרבות עד בינוני. מדולובלסטומה, הנפוצים ביותר בגידול ילדים CNS, מאופיינת בהתקדמות המהירה שלה נטייה להתפשט לאורך הציר מוח השדרה שלם עם התוצאה הקלינית העגומה. מדולובלסטומה היא גידול neuroepithelial של המוח הקטן, והיוו 20% ו -40% של גידול תוך גולגולתי ו הפוסות האחורי בילדות, בהתאמה 1. עכשיו זה מבוססת היטב כי ששש איתות מעודד ריבוי cerebellar נוירון מבשרי גרגיר (CGNPs) במהלך הפיתוח cerebellar 2-4. מחקרים רבים באמצעות מודלים העכבר, שבו מסלול ששש מופעל constitutively, מצאו קשר איתות ששש עם מדולובלסטומה 5-9. דו&quot;ח האחרונות הראו כי תת קבוצה של תאים שמקורם מדולובלסטומה Patched1 עכברים LacZ / + הם גזע סרטניים בתאים, אשר מסוגלים ליזום propogating גידולים 10. כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבודד, להעשיר ולתחזק בתאי גזע סרטניים שמקורם מודלים העכבר כמה מדולובלסטומה, עם מסלול ששש מופעל constitutively עקב מוטציה והחליק (11, hereon כאמור SmoM2), GPCR כי הוא קריטי עבור ששש מסלול ההפעלה. ברקמת כל מדולובלסטומה מבודדים, הצלחנו להקים מושבות שגשוג רבים מאוד. תאים אלה הביעו וחסונה בתאי גזע עצביים מספר סמנים כגון Nestin ו Sox2, יכול לעבור קטעים סדרתי (יותר מ 20) והיו clonogenic. בעוד גזע אלה תאים בתרבית הגידול היו קטנות יחסית, bipoar לעתים קרובות עם גרעיני גבוהה יחס cytoplasmic כאשר בתרבית בתנאים לטובת צמיחה תא גזע, הם שינו באופן דרמטי את המורפולוגיה שלהם, הוארך תהליכים תאיים רבים, שטוח ונסוג מן מחזור התא על מעבר לתא בינוני תרבות בתוספת סרום 10% שור העובר. וחשוב יותר, אלה בתאי גזע סרטניים הבדיל לתוך Tuj1 + + או NeuN נוירונים, האסטרוציטים GFAP + + ו oligodendrocytes CNPase, ובכך הדגשת עוצמה מרובה שלהם. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים הפצת medulloblastomas משני כאשר מושתלים orthotopically לעכברים המארח.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, העשרה, ותחזוקה של הגידול מדולובלסטומה בתאי גזע שמקורם בעכברים מוטנטים עם פעילות חוץ רחמי מסלול סוניק הקיפוד.

, בידוד והעשרה, ותחזוקה של גזע תאים מדולובלסטומה

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

isolation-enrichment-and-maintenance-of-medulloblastoma-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Views.  Vanderbilt University. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, העשרה, ותחזוקה של הגידול מדולובלסטומה בתאי גזע שמקורם בעכברים מוטנטים עם פעילות חוץ רחמי מסלול סוניק הקיפוד.

Video: Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) as the cell-of-origin for medulloblastoma1-4. However, the diverse clinical presentations of medulloblastoma subtypes in human patients (nodular, desmoplastic, classical and large cell/anaplastic), and the fact that medulloblastoma is found in a subset of human patients with no ectopic expression of CGNP marker5, suggest that the cellular and molecular origins of medulloblastoma are more complex and far from being completely deciphered. Therefore, it is essential to determine whether there is an alternative medulloblastoma tumor cell-of-origin based on which cell-type specific therapeutic modality can be developed. To this end, intracranial orthotopic allografting of genetically marked tumor cell types followed by subsequent analyses of secondary tumor development in recipients will allow determination of the cellular origin of tumor-initiating cells. Here we describe the experimental protocol for intracranial orthotopic allografting of medulloblastoma cells derived from primary tumor tissue, and this procedure can also be used for transplanting cells from established cell lines.

This protocol describes the isolation and dissociation of mouse medulloblastoma tissue, and subsequent allografting of the tumor cells into immunocompromised recipient mice in order to initiate secondary medulloblastoma.

Allografting orthotopic תוך גולגולתי של תאים מדולובלסטומה ב עכברים immunocompromised

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.