المؤلفون ممتنون للدعم المالي لهذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية تحت رقم 0719232 غرانت ، من قبل وزارة الطاقة الأميركية (DEFG02 - 01ER15129) ، والتي بروتي ، وشركة العلوم البيولوجية (مورغانتاون ، WV) فإن الكتاب بالشكر أيضا إلى جيسيكا ألف Stolee لمساعدتها خلال تصوير بالفيديو للبروتوكول.

بروتوكول التالية توضح الخطوات الرئيسية للelectrospray التأين الليزر التذرية (LAESI) تجربة ويقدم أمثلة ممثل للتصوير (3D) الوحشي وثلاثي الابعاد لصحة الحيوان وعينات الأنسجة النباتية. ويمكن الحصول على تفاصيل إضافية التجريبية والتقنية من أماكن أخرى. 1-6 1. إعداد وتركيب الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اذا كانت هناك حاجة sectioning ، استخدم cryomicrotome إلى مقطع إلى شرائح الأنسجة سميكة 1-10 ميكرون في -10 إلى -20 درجة مئوية ما لم خلاف ذلك أوصت لنوع الأنسجة معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام جبل على سطح مستو (على سبيل المثال ، الشريحة كيميائيا قبل تنظيف الزجاج) مباشرة من دون المعدلات الكيميائية. لأنسجة مقطوع ، أذاب جبل المقاطع وتأمين صاحب العينة للمرحلة التبريد بلتيير فور ذوبان الجليد لتركيب إبقاء الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات خلال التحليل. هناك حاجة إلى هذه الخطوة للحد من / منع الهجرة الجزيئية في هذا الباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر ، واستخدام بالوعة الحرارة مجهزة مروحة الطاقة المنخفضة لتسهيل إزالة الحرارة من المسرح بلتيير للحفاظ على الأنسجة المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة رطبة على مدى فترة ممتدة من الوقت (1-2 ساعات) ، وفحص لالتكثيف من الماء أو الجليد على سطح النسيج. تكثيف الماء يؤثر على النسيج ضارا على أداء التصوير في التجارب LAESI 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر ، واستخدام مزيل الرطوبة غرفة أو مكان العينة في غرفة تبريد البيئية مملوءة بغاز خامل (مثل غاز النيتروجين الجاف) لمنع التكثف 1 </li></ol> 2. الاستفادة المثلى من مصدر ايون LAESI مصدر ايون LAESI يتكون من الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ، سلسلة من العناصر البصرية لتوجيه الضوء والتركيز فضلا عن أصحاب عينة إضافية ، ومكونات التبريد ، ومراحل الترجمة ونظام التسليم المذيبات. الشكل 1 يوضح الترتيب النموذجي لهذه العناصر فيما يتعلق مدخل مصدر ايون الغلاف الجوي والضغط لمطياف الكتلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو موضح في الشكل 1 ، ضع عينة 15-20 ملم تحت فوهة لأخذ العينات مطياف الكتلة مخروط (د أو FP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعمل ليزر الأشعة تحت الحمراء في منتصف الموجة 2.94 ميكرون و 10 هرتز معدل الرسوب. تخفيف الإخراج إلى طاقة الليزر ~ μJ / نبض 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مزيج من المرايا الذهب وتركز عدسة شفافة على طول الموجة الليزر (على سبيل المثال ، مقهى ، بلانو عدسة محدبة أو ZnSe 2) لزوجين من الطاقة نبضة ليزر في عينة في حالات طبيعية (انظر زاوية الحق وقوع فيما يتعلق سطح العينة في الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف محور شعاع منتصف 5-8 ملم تحت الحمراء أمام فتحة أخذ العينات من مخروط مطياف الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط موضع تركيز العدسة والطاقة نبضة من شعاع الليزر لإزالة أنسجة تحقيق في نقطة بؤرية. أبعاد ablated تحديد حجم بكسل (أو فوكسل في التصوير الثلاثي الابعاد) حجم لتطبيق التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف باعث nanospray تماشيا مع محور مدخل مطياف الكتلة ، وعلى مسافة وغيض الفوهة إلى باعث من 10 مم ~ (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لelectrospray ، تجهيز 50 ٪ محلول الميثانول مع حمض الخليك بنسبة 0.1 ٪ أو 0.1 ٪ خلات الأمونيوم المضافة لوضع أيون إيجابية أو سلبية ، على التوالي. اعتمادا على نموذج ، والمذيبات العضوية الأخرى ، مثل الأسيتونيتريل ، الأيزوبروبانول ، وما إلى ذلك ، قد استبدال الميثانول بتركيزات مناسبة للقيام بهذه المهمة التحليلية. استقرار electrospray أمر حاسم لنجاح التصوير. اعتمادا على اختيار المذيبات ، ومعدل التدفق والجهد الرش بحاجة إلى تعديل لتحقيق الرش مستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن رد الفعل LAESI 6 في تطبيقات التصوير ، قد حل electrosprayed تحتوي المواد المتفاعلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة الحقن لتقديم حل electrospray من خلال باعث electrospray بمعدل تدفق NL 300 ~ / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان يتم الاحتفاظ فوهة مطياف الكتلة في الجهد المنخفض (&lt;500 V تقاس الأرض) ، وتوليد electrospray من خلال تطبيق الجهد العالي مباشرة إلى باعث electrospray (على سبيل المثال ، 3000 V) أو من خلال اتحاد المعادن. خلاف ذلك ، الأرض مباشرة أو من خلال باعث electrospray المعادن لتأسيس اتحاد electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل مصدر electrospray في شكل مخروط طائرة رش وضع لتوليد أيونات أكثر كفاءة من خلال LAESI. لتأثير المتغيرات التي تعمل على وسائل الرش وتأثيرها على أطياف الشامل ، انظر المناقشات في مكان آخر. 5،7،8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المسافات بدقة نسبية من الإعداد الأمثل لLAESI العائد ايون LAESI مع الحفاظ على شعاع الليزر ، وباعث ، ومحاور فتحة في الطائرة نفسها. يرجى العثور على تعليمات مفصلة في مكان آخر. 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع المجهر الضوئي ، وتحديد أبعاد الوحشي من الحفرة الاجتثاث على العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة ثلاثة الابعاد تجارب التصوير LAESI ، نفذ الاجتثاث مع نبضات فردية وتحديد عمق فوكسل به ، على سبيل المثال ، وضع ض المكدس في المجهر الضوئي. 3 </li></ol> 3. التصوير الجزيئي وتحليل البيانات في التجربة والتصوير ، ويتم نقل عينات الأنسجة في الطائرة البؤرية ليزر في اتجاهات X و Y مع أحجام أكبر من خطوة أو مساوية لأبعاد المكان الاجتثاث. يقتصر القرار المكانية التي تركز الحادث شعاع الليزر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مجال الاهتمام على سطح العينة ، والحصول على (X ، Y) إحداثيات الحدود المناظرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختار خوارزمية gridding (على سبيل المثال ، على التكيف الشبكة ، وتحديد منطقة التصوير ، والشبكة مستطيلة ، ولبي ، Z المسح الضوئي ، الخ) التي لالنقطية سطح العينة المختارة مع الوقت يسكن في كل بكسل على المنطقة المراد تصويره. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مرحلة الترجمة ثلاثة محاور وبرامج قادرة على rastering العينة وفقا لشبكة محددة سلفا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الوقت الإجمالي المطلوب للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل الوقت اكتساب الحد بيانات مطياف الكتلة. إذا كان هذا غير ممكن ، تعيين وقت اقتناء البيانات للحد من قيمة التصوير الوقت محسوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء مصدر ليزر الأشعة تحت الحمراء في منتصف معدل التكرار المناسبة لانتاج ما يكفي من الإشارات إلى نسبة الضوضاء في الطيف الشامل في غضون الوقت يسكن في كل بكسل لإجراء تجربة التصوير LAESI الجانبية. للتصوير الجزيئي 3D ، استخدام معدل اقتناء الطيف أعلى من معدل تكرار الليزر المصدر إلى بنجاح الشامل تحليل الأيونات المتولدة داخل نبضة ليزر واحد. تنتظر إشارة البدء لبدء تسلسل الاجتثاث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر electrospray. تأكد من أن هناك حلا كافيا للمرة الكامل اللازم للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستارت واحد الحصول على أطياف الشامل ، والتذرية الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ، ومسح السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما انتهى التصوير تشغيل ، إيقاف مسح السطح ، وlasing منتصف الأشعة تحت الحمراء ، والحصول على البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل مصدر الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف الجهد العالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف ضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مطياف الكتلة إلى وضع الاستعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف الالكترونيات بلتيير التبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق خامل تدفق الغاز في حالة استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برمجيات لربط الإحداثيات المطلقة من بكسل في التصوير الجانبي أو في التحليل وvoxels 3D مع الأطياف المقابلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم إشارة كثافة الأيونات لقيمة م / ض مختارة ضد الإحداثيات المطلقة للتحليل الجزيئي للحصول على صور الوحشية و 3D. </li></ol> 4. ممثل النتائج الشكل 2 يعطي نتائج ممثل لبعض أنواع الأنسجة الرئيسية وطرائق التصوير. لوحة ويصور الحال بالنسبة لحيوان القسم الأنسجة التي جمدت خلال التجربة لمنع الجفاف. (1) وبالإضافة إلى ذلك ، تم وضع العينة في بيئة النيتروجين الغاز الجاف لتجنب أبخرة المياه المحيطة من تكاثف على سطح العينة. تم تصوير قسم أفقيا 100 ميكرون سميكة الاكليلية من دماغ فأر (الجرذ النرويجي) مع LAESI. المناطق التشريحية للدماغ (انظر الصورة البصرية في لوحة أ) تبين علاقة جيدة مع الصور التي تم الحصول عليها الجزيئية للكمبيوتر plasmalogens (O - 33 : 3) و / أو PE (O - 36 : 3) مع م / ض 728.559. لوحة باء يظهر التصوير LAESI 3D محطة زيبرا (Aphelandra squarrosa) أنسجة نبات. لأن يترك تمتلك آلية دفاعية طبيعية ضد الجفاف ، يمكن استجوابه العينة في البيئة المحيطة. (3) الحصول على صور الجزيئية 3D كشفت مجموعة متنوعة من أنماط التوزيع للالأيضات الابتدائية والثانوية. من بين أمور أخرى ، تم الكشف عن acacetin مع م / ض 285.076 في تعداد أعلى ايون في القطاعات الصفراء من طبقات الثانية والثالثة من أعلى مع توزيع متجانس في الآخرين. وافق هذا التوزيع مع نمط وتلون ينظر في الصورة الضوئية. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التخطيطي للنظام LAESI (ES ، electrospray غيض باعث ، أو ، من فوهة مطياف الكتلة مخروط أخذ العينات ؛ FL ، تركز العدسة ؛ FP ، نقطة محورية ؛ P ، بلتيير التبريد المرحلة ؛ HS ، بالوعة الحرارة). جزء من الجسيمات طرد خلال منتصف IR الاجتثاث (النقط الحمراء) coalesces مع electrospray لانتاج قطرات اتهم المصنف مع الجزيئات والأيونات من العينة (نقطة خضراء). ويتم تحليل الأيونات المفرج عنهم من هذه القطرات والتي سجلتها في مطياف الكتلة. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ممثل عن النتائج imagi الوحشي و 3D. نانوغرام مع LAESI الطيف الكتلي (A) لوحة تصور أعلى الصورة البصرية للدماغ فأر (الجرذ النرويجي) القسم الاكليلية والحصول على صورة الجزيئية للكمبيوتر plasmalogens (O - 33 : 3) و / أو PE (O - 36 : 3) مع م / ض 728.559. شريط أبيض على نطاق يناظر 1 ملم. تكييفها مع إذن من (المرجع 1). حقوق الطبع والنشر 2010 الجمعية الكيميائية الأمريكية. (ب) لوحة أسفل يظهر التصوير 3D من ورقة من نبات زيبرا المتنوعة (Aphelandra squarrosa). تم الكشف عن Acacetin مع م / ض 285.076 في تعداد أعلى ايون في القطاعات الصفراء من طبقات الثانية والثالثة من أعلى مع توزيع متجانس في الآخرين. طبع بإذن من (المرجع 3). حقوق الطبع والنشر 2009 جمعية الكيميائية الاميركية.

<ol>
	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

أنواع الأنسجة المختلفة المعرض متفاوتة المحتوى المائي وقوة الشد ، والتي ، بدورها ، يمكن أن تؤثر على الخصائص الاجتثاث من العينات. 9 وللتخفيف من هذه الآثار ، من المرغوب فيه أن يعاد النظر في فلوينس الليزر ، والتعامل مع العينة ، وتحليل بروتوكولات عند تغيير بين أنواع الأنسجة الرئيسية. لخلية واحدة أو التحقيقات أعلى القرار ، يمكن أن يقترن ضوء الأشعة تحت الحمراء في منتصف الألياف البصرية بدلا من شحذ عدسة التركيز. 10 من خلال تحديد المواقع غيض من الألياف مقربة من الخلايا المحددة في الأنسجة ، يمكن إجراء تحليل على LAESI مستوى وحيدة الخلية. كتسمية خالية من مصدر لايون المحيطة التأين مطياف الكتلة ، فقد أظهرت 11 LAESI امكانات كبيرة للتحقيق في العمليات الكيميائية الحيوية في الأنسجة. مع فوائد إضافية من التحليل المباشر ، والتصوير الأفقي و 3D ، LAESI أداة الناشئة عن التنميط bioanalytical فضلا عن تطبيقات التصوير.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

الطرق المحيطة التأين مطياف الكتلة في السماح تنفيذ التحقيقات التحليلية مباشرة على النسيج أو بيوفيلم تحت ظروف تشبه الأم التجريبية. التأين electrospray الليزر التذرية (LAESI) هو أحد هذه التنمية ، وخاصة مناسبة تماما للتحقيق في المياه المحتوية على العينات. LAESI تستخدم شعاع ليزر تحت الحمراء منتصف (2.94 ميكرون الطول الموجي) لإثارة جزيئات الماء من العينة. عندما يتم تجاوز عتبة فلوينس التذرية ، وطردت مادة العينة في شكل جسيمات وهذه المقذوفات السفر لعشرات ملليمتر فوق سطح العينة. في LAESI ، يتم اعتراضها من قبل هذه السحابة قطرات الاجتثاث مشحونة لالتقاط جزء من مادة العينة طرد وتحويل مكوناتها الكيميائية في المرحلة أيونات الغاز. يعمل مطياف الكتلة مجهزة واجهة الغلاف الجوي الأيوني مصدر ضغط على تحليل وتسجيل تكوين أيونات سراح القادمة من منطقة بحث (بكسل) من العينة. استجواب المنهجي على مجموعة من بكسل يفتح الطريق أمام التصوير الجزيئي في تحليل وضع مسبار مجهري. ومن الجوانب الفريدة للتصوير الطيفي الشامل LAESI هو التنميط عمق ذلك ، بالاشتراك مع التصوير الجانبي ، وتمكن ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير الجزيئي. مع القرارات الحالية الوحشي وعمق ميكرومتر 100 ~ ~ 40 ميكرون و، على التوالي ، LAESI التصوير الطيفي الشامل يساعد على استكشاف التركيب الجزيئي للالأنسجة البيولوجية. هنا ، علينا إعادة النظر في العناصر الرئيسية للنظام LAESI وتوفير مبادئ توجيهية لإجراء تجربة ناجحة التصوير.

Watch this Scientific Journal Video about Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry at JoVE.com

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

التأين electrospray الليزر التذرية (LAESI) هي مصدر الضغط الجوي ايون لقياس الطيف الكتلي. في وضع التصوير ، ومجسات ليزر تحت الحمراء في منتصف توزيع الجزيئات عبر الباب أو الأنسجة بيوفيلم ملف. هذا الأسلوب يقدم نهجا جديدا للدراسات bioanalytical المتنوعة التي تنفذ في ظل الظروف التجريبية الأصلية.

الضغط الجوي التصوير الجزيئي من الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية التي LAESI طيف الكتلة

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  George Washington University. التأين electrospray الليزر التذرية (LAESI) هي مصدر الضغط الجوي ايون لقياس الطيف الكتلي. في وضع التصوير ، ومجسات ليزر تحت الحمراء في منتصف توزيع الجزيئات عبر الباب أو الأنسجة بيوفيلم ملف. هذا الأسلوب يقدم نهجا جديدا للدراسات bioanalytical المتنوعة التي تنفذ في ظل الظروف التجريب...

Video: Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

تعريب كمية البروتين غولجي بالتصوير كتلته مركز الأسفار

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...