ونحن ممتنون إلى المختبر لإجراء مناقشات مفيدة مارتن. ويدعم هذا المنشور من خلال منحة من المعهد الكندي للبحوث الصحية (MOP - 89783). معتمد بواسطة كرسي أبحاث كندا جائزة الفئة الثانية.

الخطوة الأولى : عزل خلايا B الطحال عبر تخصيب المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسابيع فئران التجارب لضمان النضج التام للنظام المناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم ونقع في الايثانول 70 ٪. إزالة الطحال جراحيا عن طريق شق طريق الجلد والعضلات من hypochondrium الأيسر من البطن وقطع عليه في ثلاث قطع كبيرة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). التأكد من أن كل الأدوات والكواشف ومعقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1 مل ، برفق الهريس والطحال من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. تأكد من استخدام اقتراح دفع بدلا من الحركة وطحن طحن قد تؤدي إلى تمزق الخلايا أكبر (أي تكاثر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في الخلايا لا يزيد عن 350 جرام لمدة 5 دقائق وresuspend وبيليه في برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام معلق عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد الوقف من الخلايا 1x10 8 / مل في برنامج تلفزيوني مع 5 ٪ مصل الفئران العادية في معقمة 5 مل أنبوب البوليسترين مع قبعة (حجم أقصى 2 مل في أنبوب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من EasySep ماوس اختيار السلبية كوكتيل B التخصيب خلية لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر اختيار البيوتين EasySep كوكتيل لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من النانوية المغناطيسية EasySep (ضمان النانوية تمتزج جيدا ، والحل هو متجانسة) لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعلى الحل ل2.5mL مع برنامج تلفزيوني وتجري في المغناطيس EasySep لمدة 5 دقائق. عكس المغناطيس وأنبوب بسرعة وتصب في أنبوب البوليسترين جديدة. لا تهزه أنبوب كما سيتم تحديد الخلايا مغناطيسيا ملزمة سلبا على جدران الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وذلك لزيادة نقاء التعليق الخلية ، قد يتم إعادة إدراج أنبوب إلى المغناطيس لمدة 5 دقائق إضافية ، وسكب في أنبوب جديد. هذا قد خفض إجمالي الانتعاش الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تقييم B نقاء خلية تحليل تدفق cytometric علامات B سطح الخلية. بعد تخصيب ، ونحن نرى دائما نقاء من الخلايا&gt; 95 ٪ ايجابي B220. </li></ol> الخطوة الثانية : CFSE تلوين الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا المعزولة في برنامج تلفزيوني الدافئة تستكمل مع المصل البقري بنسبة 0.1 ٪ عند تركيز الألبومين النهائي 1 × 6 10 خلايا لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من 5mM CFSE (مخفف في سلفوكسيد ثنائي ميثيل العقيمة) وإضافة 2μL لكل مليلتر من الخلايا في الأنبوب. التركيز النهائي لل10μM هو الأمثل لتلطيخ من الخلايا باء الابتدائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في الظلام (ملاحظة : CFSE خفيفة حساسة ويجب أن تبقى في الظلام عندما يكون ذلك ممكنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد صمة عار عن طريق إضافة حجم مساو من مصل العجل البقري إلى خلاياك وتفرخ على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا التي تحتل المرتبة الاولى تصل الأنابيب مع الثقافة المتوسطة (انظر الخطوة الثالثة للصفة) والطرد المركزي في 350 غرام. علما أنه يجب أن يضاف ما لا يقل عن 5 مرات ما يعادل حجم وسائل الإعلام للتصدي لزوجة من المصل البقري والعجل للخلايا لانتاج بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا أكثر مرتين في المتوسط ​​الثقافة. الخلايا هي الآن جاهزة للتحفيز. </li></ol> الخطوة الثالثة : تحفيز الخلية مع LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المختبر الخاص في الخلية B مستنبت من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10 ٪ مصل العجل الجنين و 50 ميكرومتر / β - المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة التحفيز الخاص بإضافة LPS بتركيز نهائي 50μg/mL. قسامة 125 ميكرولتر من التحفيز المتوسطة في كل جانب من قاع مسطح 96 - جيدا وحة زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الخلايا B CFSE الملطخة في مستنبت دون LPS بتركيز نهائي قدره 3.2 × 10 6 خلية / مل. إضافة 125 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى الآبار التي تحتوي على التحفيز والمتوسطة الخاص الخليط بواسطة pipetting بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل بئر يحتوي الآن على 10 5 4 × الخلايا في تركيز LPS النهائية من 25 ميكروغرام / مل. وهذا يوفر المستويات المثلى من تكاثر الخلايا والتحول الطبقي ، على الرغم من التعديلات التي قد تكون لهذه القيم كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 72 إلى 96 ساعة. بعد 48 ساعة ، ومجموعات كبيرة الخلايا المتكاثرة B تكون مرئية بوضوح تحت المجهر. </li></ol> رابعا الخطوة : تحليل تدفق cytometric التحول الطبقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما كنت على استعداد للنظر في تبديل الطبقة ، وإزالة الخلايا الخاصة بك من ظروف ثقافتهم وغسلها مرتين في 1 مل من تلطيخ العازلة (PBS مع 2 ٪ مصل العجل البقري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع غير محددة تلوين الأجسام المضادة لخلايا الخاص بك ، بيليه الخلايا من خلال الدوران عليهم في 350 غرام وincubaالشركة المصرية للاتصالات لهم في 100μL من تلطيخ العازلة مع 5 ٪ مصل الفأر العادي و1μg الخلايا per106 FcBlock لمدة 15 دقيقة على الجليد. يجب أن يتم تنفيذ حظر خلية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون غسل خلايا الجسم ، إضافة 1μg في الخلايا 6 10 من الأضداد المضادة الموسومة fluorescently IgG3 الماوس وتسمح للخلايا لصبغ لمدة 30 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي ، ومرتين في resuspend 200-300 ميكرولتر من تلطيخ العازلة. الخلايا على استعداد الآن للتقييم من قبل التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو متحمس بشكل أمثل في CFSE 492 نانومتر (بواسطة ليزر أيون الأرجون) وتنبعث في 517 نانومتر. الطيف الإثارة وانبعاث الجسم المضاد IgG3 يعتمد على صبغة الفلورسنت المتقارن لها. </li></ol> ممثل النتائج بعد تخصيب المغناطيسي ، ينبغي تعليق خلية تبدو وكأنها متجانسة من السكان الخلايا تمييزه دائرية صغيرة (الشكل 1A). بعد 48-72 ساعة من التحفيز ، ومجموعات معزولة من تضخم الخلايا المتكاثرة تكون مرئية بشكل واضح (الشكل 1B). وهناك نسبة كبيرة من الخلايا غير الصغيرة وتتكاثر تظهر حبيبات لأنها تخضع لموت الخلايا المبرمج. يمكن عادة يتم الكشف عن المسؤولية الاجتماعية للشركات على أعلى المستويات بين 72 و 96 ساعة بعد التحفيز قبل معظم الخلايا تموت 7. في هذه المرحلة ، يجب أن خضعت لعدد من الخلايا الانقسامات الخلوية مع تبديل الخلايا التي تظهر في الخلية في وقت لاحق ابنة السكان. ويمكن رؤية تدفق مؤامرة ممثل cytometric التخفيف CFSE والتعبير سطح IgG3 بعد 96 ساعة من التحفيز LPS في الشكل 2. الجدول 1. Isotype التبديل الكوكتيلات. ملاحظة : قيم تركيز المنشطات هي توصيات فقط. قد يكون من الضروري المعايرة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المطلوب Isotype </td><td> التحفيز كوكتيل </td></tr><tr><td> IgG1and إيج </td><td> LPS (25μg/mL) و IL - 4 (10 نانوغرام / مل) </td></tr><tr><td> IgG1and إيج </td><td> مكافحة CD40 (10μg/mL) و IL - 4 (10 نانوغرام / مل) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) ، والإنترفيرون γ (10 نانوغرام / مل) </td></tr><tr><td> وIgG2b IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> ايغا </td><td> LPS (25μg/mL) ، TGF - β (2 نانوغرام / مل) و IL - 5 (1.5 نانوغرام / مل) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. عزل وLPS تحفيز خلايا B الطحال. (أ) المخصب مغناطيسيا خلايا B الطحال قبل التحفيز LPS. (ب) بعد 48 ساعة من التحفيز مع 25 ميكروغرام / مل من LPS. وتعتبر الخلايا المتكاثرة في شكل مجموعات من الخلايا خلفية التفجير وأفكارك. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الانتشار وإعادة التركيب الطبقي التبديل بعد 96 ساعة. (أ) لحفز تخفيف CFSE LPS الخلايا بعد 96 ساعة في الثقافة. كل مستقل يمثل الذروة في التخفيف مضان CFSE المقابلة لانقسام الخلايا المستقلة. (ب) IgG3 التعبير تبين ظهور السكان IgG3 إيجابية بعد عدة جولات من انقسام الخلايا.

<ol>
	<li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number.">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li><li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes.">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li><li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination.">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li><li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells.">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNF8/RNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination.">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li><li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis.">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class-switch+recombination:+interplay+of+transcription,+DNA+deamination+and+DNA+repair.">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha,+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b.">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+class+switching+differs+among+SJL,+C57BL/6+and+129+mice.">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بروتوكول المبينة أعلاه يوفر الفحص القياسية لتحليل التعبير AID وظيفة خلال تبديل طبقة من الخلايا الأولية باء الفئران. هذا البروتوكول يستخدم LPS البكتيرية للحث على التحول من الغلوبولين المناعي لIgG3 ، على الرغم من أن تتمكن من إجراء تعديلات على وسائل الإعلام للحث على تحفيز ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemcell Technologies</td>
<td>19754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34554</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 Culture Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L6529</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30396.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>011-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Anti-Mouse IgG3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553401</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells

الحصانة الخلطية هي فرع من فروع الجهاز المناعي التي تحتفظ بها الخلايا البائية وتوسطت من خلال إفراز الأجسام المضادة. عند تنشيط خلايا B ، بموضع المناعي يخضع لسلسلة من التعديلات الوراثية لتغيير القدرة ملزمة وظيفة المستجيب يفرز الأجسام المضادة. ومن ابرز هذه العملية من خلال إعادة التركيب الجيني حدث المعروفة باسم التهجين تبديل فئة (CSR) التي يتم فيها استبدال الضد الغلوبولين المناعي isotype الافتراضي لأحد IgG و IgA ، أو إيج. كل isotype تمتلك وظائف متميزة المستجيب مما يجعل المسؤولية الاجتماعية للشركات حاسما في الحفاظ على الحصانة. وتوسطت تنويع موضع المناعي من سيتيدين انزيم نازعة أمين التنشيط التي يسببها (AID). شريط فيديو التخطيطي اصفا هذه العملية بالتفصيل على شبكة الإنترنت (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). عادة يتم دراسة النشاط المعونة ومسار المسؤولية الاجتماعية للشركات في تقييم وظيفة الخلايا باء والحصانة الخلطية في الفئران. بروتوكول المبينة في هذا التقرير وسيلة لعزل الخلايا B من الطحال الفئران والتحفيز لاحقة مع lipopolysaccharide البكتيرية (LPS) للحث على التحول إلى فئة IgG3 (على الضد isotypes الأخرى أنظر الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام صبغة الفلورسنت تلوين الخلية Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لمراقبة تقسيم خلية من خلايا حفز ، وهي عملية حاسمة لisotype التبديل 1 و 2. تنظيم المساعدات والآلية التي يحدث المسؤولية الاجتماعية للشركات لا تزال غير واضحة ، وبالتالي في فحوصات المختبر تبديل فئة توفر طريقة موثوق بها لاختبار هذه العمليات في نماذج الماوس المختلفة. كانت هذه المقايسات التي سبق استخدامها في سياق نقص الجينات باستخدام الفئران بالضربة القاضية 3. وعلاوة على ذلك ، يمكن التبديل في المختبر من خلايا B يسبقه تنبيغ الفيروسية لتعديل التعبير الجيني بواسطة الحمض النووي الريبي ضربة قاضية أو التحوير التعبير 4-6. أثرت البيانات من هذه الأنواع من التجارب فهمنا للنشاط AID ، القرار من ردود الفعل المسؤولية الاجتماعية للشركات ، والأجسام المضادة التي تتوسط فيها الحصانة في الماوس.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

عقب التعرض لمستضد ، مجموعات سكانية فرعية من الخلايا باء يمكنهم الخضوع لعملية إعادة التركيب المعروفة باسم الطبقة التبديل (CSR) لإنتاج الأجسام المضادة مع وظائف isotypes المستجيب متميزة. بروتوكول المبينة في هذا التقرير يشرح كيف يمكن أن يتسبب المسؤولية الاجتماعية للشركات وتحليلها<em&gt; في المختبر</em&gt; لأغراض الدراسة وظيفة الخلايا باء.

الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Views.  University of Toronto. عقب التعرض لمستضد ، مجموعات سكانية فرعية من الخلايا باء يمكنهم الخضوع لعملية إعادة التركيب المعروفة باسم الطبقة التبديل (CSR) لإنتاج الأجسام المضادة مع وظائف isotypes المستجيب متميزة. بروتوكول المبينة في هذا التقرير يشرح كيف يمكن أن يتسبب المسؤولية الاجتماعية للشرك...

Video: Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA recombination (CSR), and plasma cell differentiation. In recent years, epigenetic modifications or factors, such as histone deacetylation and microRNAs (miRNAs), have been shown to interact with B-cell genetic programs to shape antibody responses, while the dysfunction of epigenetic factors has been found to lead to autoantibody responses. Analyzing genome-wide miRNA and mRNA expression in B cells in response to epigenetic modulators is important for understanding the epigenetic regulation of B-cell function and antibody response. Here, we demonstrate a protocol for inducing B cells to undergo CSR and plasma cell differentiation, treating these B cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors (HDIs), and analyzing mRNA and microRNA expression. In this protocol, we directly analyze complementary DNA (cDNA) sequences using next-generation mRNA sequencing (mRNA-seq) and miRNA-seq technologies, mapping of the sequencing reads to the genome, and quantitative reverse transcription (qRT)-PCR. With these approaches, we have defined that, in B cells induced to undergo CSR and plasma cell differentiation, HDI, an epigenetic regulator, selectively modulates miRNA and mRNA expression and alters CSR and plasma cell differentiation.

Epigenetic factors can interact with genetic programs to modulate gene expression and regulate B cell function. By combining in vitro B-cell stimulation, qRT-PCR, and high-throughput microRNA-sequence and mRNA-sequence approaches, we can analyze the epigenetic modulation of miRNA and gene expression in B cells.

على نطاق الجينوم التحوير بوساطة "تحليل المانع هداك" ميكرورناس ومرناس في "ب الخلايا التي يسببها" للخضوع تبديل فئة جزئ الحمض النووي وتمايز خلية البلازما

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

في المختبر و في فيفو التقييم تي وب وخلايا النقوي النشاط القمعية واستجابات خلطيه من المتلقين زرع

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.