يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين بدراسة كيفية إنتاج الجهاز المناعي لأجسام مضادة لمسببات الأمراض أو الميكروبات كومنسال. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة المسارات الجزيئية التي تنظم تنويع الجينات المناعية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا. يستخدم البروتوكول مزيجا من تقنيات البيولوجيا الجزيئية الشائعة بما في ذلك تسلسل PCR وSanger ولا يتطلب فرز خلية واحدة أو تسلسلا عميقا.
يمكن الخلط بسهولة بقع باير مع الأنسجة الدهنية المحيطة بها. لذلك قد يكون العرض البصري لهذه الطريقة مفيدا لأولئك الذين ليسوا على دراية بهذا الجهاز لتحديد موقعه ومراقبة تشريحه. ابدأ بوضع الماوس على لوحة التشريح مع تعرض البطن.
رش بسخاء جسم الماوس مع 70٪ الإيثانول قبل إجراء أي شقوق لتعقيم منطقة تشريح. إجراء شق في الجلد عبر البطن وسحب في وقت واحد على جانبي الشق مع الأصابع أو ملقط. ثم قطع تجويف الصفاق مع مقص لفضح الأعضاء الداخلية.
تحديد موقع الأمعاء الدقيقة وإزالتها عن طريق قطع تحت المعدة وفوق ال cecum. إزالة أي النسيج الضام والدهون ربط طيات الأمعاء الدقيقة معا. فحص السطح الخارجي للأمعاء الدقيقة لبقع باير، وهي هياكل بيضاوية الشكل صغيرة تظهر بيضاء تحت طبقة رقيقة من الخلايا الظهارية الشفافة.
اقتطع بعناية جميع بقع باير المرئية بمقص واجمعها في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من عازل FACS على الجليد. إذا كانت الأنسجة التي تم جمعها تغرق إلى أسفل الأنبوب ، فهي في الواقع رقعة باير وليس الأنسجة الدهنية. ضع مرشح 40 ميكرو متر في طبق بئر ستة مع ملليلتر واحد من العازلة FACS الباردة، ثم صب بقع باير من أنبوب 1.5 ملليلتر على المرشح.
استخدام نهاية مسطحة من المكبس من حقنة ملليلتر واحد كحشرات لسحق بقع باير على مرشح حتى يبقى فقط النسيج الضام. اغسل الفلتر والمغطاس مع ملليلتر واحد من العازلة FACS الباردة لإطلاق سراح الخلايا في طبق البئر الستة. جمع الخلايا وتصفية لهم من خلال 40 ميكرومتر مصفاة كاب FACS أنبوب.
ثم غسل غطاء مصفاة مع ملليلتر واحد من العازلة FACS الباردة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 600G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم decant العملاقة وإعادة إنفاق الخلايا في 0.4 ملليلتر من العازلة FACS الباردة مع كتلة FC.
احتضان العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة ثم غسل بيليه الخلايا. لتلطيخ الخلايا B مركز Germinal أو GCBCs، resuspend خلايا النوع البري في 80 ميكرولتر من العازلة FACS. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا من بقع نوع البرية باير لكل عنصر تحكم تلطيخ.
ترك 40 ميكرولتر من تعليق الخلية للعينات التجريبية. بدلا من ذلك، استخدم حبات التعويض لعناصر التحكم في التلطيخ. وصمة عار كل من العينات التجريبية في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة مع 2.5 ميكرولتر من البيوتين PNA لمدة 15 دقيقة على الجليد.
ثم غسل خلايا بقع السلطة الوطنية الفلسطينية. وصمة عار كل عينة مع 500 ميكرولتر من كوكتيل GCBC في الظلام وعلى الجليد لمدة 15 دقيقة، والتأكد من أن يتم إعادة إنفاق الخلايا بالكامل في الكوكتيل. لإعداد عناصر تحكم وصمة عار واحدة لمصفوفة التعويض، وصمة عار الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة باستخدام التخفيف المحدد في النص.
احتضان ضوابط تلطيخ في الظلام على الجليد لمدة 15 دقيقة. إضافة اثنين من ملليلتر من العازلة FACS الباردة لغسل جميع عينات وصمة عار والضوابط. بيليه الخلايا والتخلص من supernatant قبل إعادة تعليق الخلايا في حجم نهائي من 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة لتشغيل على مقياس الخلايا.
ثم، استخدم مفرز الخلية لجمع B220 إيجابية الخلايا العالية السلطة الوطنية الفلسطينية من كل عينة تجريبية ملطخة. لاستخراج الحمض النووي من الخلايا B مركز Germinal أو GCBCs، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من الحمض النووي استخراج العازلة وخمسة ميكرولتر من بروتيناز K.Then يعجل الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من الايزوبروبانول وميكرولتر واحد من الجليكوجين. وخلط الأنبوب جيدا عن طريق عكس ذلك خمس أو ست مرات.
بعد احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، طارد مركزي لمدة 15 دقيقة في 21، 000G و 25 درجة مئوية. التخلص من supernatant وغسل بيليه الحمض النووي مع ملليلتر واحد من الإيثانول 70٪. طرد الحمض النووي في 21، 000G لمدة 10 دقائق، ثم إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه لمدة خمس إلى 10 دقائق.
Resuspend الحمض النووي في 30 ميكرولتر من العازلة TE واحتضانه بين عشية وضحاها في 56 درجة مئوية. تنفيذ PCR المتداخلة ل JH4 Intron. تطبيع الكمية الإجمالية للحمض النووي الجينومي المستخدم في أول PCR إلى العينة الأقل تركيزا.
بعد تشغيل منتجات PCR على هلام، واستئصال أمبليكون وتنقية مع عدة استخراج هلام. ثم رفع دعوى على amplicon إلى بلازميد وتحويل الخلايا البكتيرية الكهربائية المختصة مع اثنين من microliters من رد فعل الربط. Electroporate الخلايا في 1.65 كيلوفولت وانقاذهم في 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام SOC لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 225 دورة في الدقيقة.
لوحة 100 ميكرولتر من البكتيريا المحولة على لوحات أجار LB تكملها أمبيسلين واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تسلسل الحمض النووي البلازما من المستعمرات البكتيرية ومحاذاة التسلسلات التي تم الحصول عليها لكل PCR ضد تسلسل مرجعي JH4 Intron باستخدام برنامج أوميغا كلوستال. تحديد الاختلافات من التسلسل المرجعي كطفرات.
تم التعرف على الخلايا B مركز Germinal عن طريق قياس التعبير عن مستقبلات B220 وملزمة من agglutinin الفول السوداني. كانت بقع باير البرية تحتوي على متوسط 4 ملايين خلية لكل فأر. وحوالي 8٪ من الخلايا كانت B220 إيجابية السلطة الوطنية الفلسطينية عالية وهو نصف تلك التي لوحظت في الفئران خروج المغلوب الإيدز.
من بين 105 تسلسلات فريدة تم الحصول عليها من خلايا المركز الجرثومي البري B ، تم العثور على ما مجموعه 226 طفرة. وأظهر تحليل طيف الطفرات مجموعة من التحولات والإصدارات العابرة بمعدل أربعة أضعاف 10 إلى الطفرات الثالثة السلبية لكل زوج أساسي. تم تحديد طفرتين فقط في 113 تسلسل خروج المغلوب الإيدز.
بالإضافة إلى ذلك، كل منتج JH4 PCR من نوع البرية Germinal مركز B الخلايا، تحتوي على واحد إلى 25 الطفرات مع طفرات متعددة وجدت في كثير من الأحيان على تسلسل واحد. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تبقي الخلايا على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد تلطيخ الخلايا، والحفاظ على الخلايا في الظلام لمنع photobleaching الفلوروفوريس.
لربط فرط التبدل الجسدي مع نضوج تقارب الأجسام المضادة ، نوصي باستخدام بروتوكول التحصين والححوص عن تزازات الأجسام المضادة المحددة وطفرات منطقة V.
