معتمد من قبل البرنامج CK الدراسات العليا في جامعة كولومبيا. UB هو زميل اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية جمعية الأمريكية ، وحاصل على جائزة الباحث جديد من مؤسسة أبحاث اللوكيميا ومعتمد من قبل جامعة كلية كولومبيا الجديد البدء الأموال.

1. الطحال الليمفاوية B - العزل وتحفيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الطحال من الفئران التي تعاني من نقص المعونة 12 بين 2-3 أشهر من العمر. يتم تنفيذ عزل الطحال في ظروف معقمة ويتم الاحتفاظ مؤقتا في أجهزة المالحة الباردة العازلة الفوسفات (PBS) التي تحتوي على 15 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقل الطحال لغطاء نسيج الثقافة العقيمة والمتجانس في 5 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع FBS 2.5 ٪. نقل جناسة لأنبوب 15 مل الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لعينة نسيج متجانس الطحال في 1000rpm لمدة 10 دقائق على 4 إلى خلايا بيليه درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب وطاف بعد الطرد المركزي. Resuspend بيليه في الخلية في 10 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) العازلة تحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق لتجنب التلوث بواسطة خلايا الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، وسكب وطاف resuspend الخلايا في 10 مل تحتوي على 2.5 ٪ PBS FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 100 ميكرولتر قسامة وعدد الخلايا في التخفيف 1:1000 باستخدام عدادة الكريات قياسي باستخدام التريبان الأزرق لاستبعاد أي خلايا ميتة. ويمكن الحصول على الخلايا حوالي 2-30 في الطحال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 1000rpm لمدة 10 دقائق ، وطاف في صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية 0.5 ٪ في جيش صرب البوسنة / PBS 2mm والتي تحتوي على EDTA بتركيز 10 7 90 خلية لكل ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مكافحة CD43 الأجسام المضادة الخرز المغناطيسي المغلفة لخلايا لربط غير محدد B الخلايا. استخدام الخرز 10 ميكرولتر بنسبة 90 ميكرولتر (10 7 خلايا). مزيج جيد واحتضان عند 4 لمدة 20 دقيقة درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تسمية الخلايا ، ويغسل لهم بإضافة 2.5 ٪ FBS / PBS إلى رأس الأنبوب. عينة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب وطاف. Resuspend الخلايا في 0.1 ٪ BSA / PBS بتركيز 10x10 7 خلايا لكل مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل عمود الفرز المغناطيسي على فاصل المغناطيسي. موقف انبوب مخروطي مباشرة أسفل العمود لجمع التدفق من خلال وتحميل العمود مع 0.5 ٪ 3mL جيش صرب البوسنة / PBS لرئيس الوزراء ويغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يغسل السائل قد تدفقت من خلال استبدال أنبوب المجموعة الجديدة. إذا كانت العينة أقل من 1 مل ، وضبط حجم العينة إلى 1 مل من 0.5 ٪ مع جيش صرب البوسنة / PBS / EDTA وتحميل العينة في العمود. تحميل فقط كحد أقصى 1 مل من الخلايا في العمود واستخدام أعمدة متعددة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح هذه الخلايا إلى تدفق سلبي من خلال عمود ، وجمع الخلايا غير منضم في أنبوب مخروطي تحت العمود. غسل العمود 4 مرات مع 3 مل من 0.5 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني مع الاستمرار في جمع من خلال تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل التدفق من خلال التي سيتم المخصب CD43 السلبية خلايا B يستريح. تجاهل العمود. أجهزة الطرد المركزي في التدفق من خلال 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف طاف وإضافة 10 مل المتوسطة (15 ٪ FCS / + الجلوتامين ، القلم / بكتيريا ، غير الأحماض الأمينية الأساسية ، و 50 ميكرومتر Β - ME) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا في الخلايا والثقافة في 6 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تحفيز نمو الخلايا وباء انتشار الأسلحة النووية ، مع استكمال المتوسطة المؤتلف الضد IL - 4 - CD40 ومكافحة مثل هذه التركيزات النهائية هي 20 ميكروغرام / مل و 1 ميكروغرام / مل على التوالي ، ونقل الخلايا إلى قارورة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها. عدد الخلايا والخلايا لتمييع 6 10 لكل لتر ، مضيفا IL - 4 و CD40 ، حسب الاقتضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا لمدة 72 ساعة قبل أن العدوى الفيروسية. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن من الخلايا المنتجة استخدام البروتوكولات المعمول بها لترنسفكأيشن باستخدام الدهون الموجبة أو فوسفات الكالسيوم. Transfect 10cm 3 لوحة في بناء الحمض النووي ، وذلك باستخدام الحمض النووي 100 ميكروغرام البلازميد في اللوحة. نحن نستخدم أسلوب روتيني ترنسفكأيشن الكالسيوم الفوسفات 13 و 14 و علما عيار الفيروسية عالية عندما تستكمل مع الكلوروكين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 60 ٪ -70 ٪ متموجة فينيكس الخلايا لتكون خلايا transfected المنتجة. وينبغي في هذه التقاء خلايا تكون 5 ملايين الخلايا في الصفيحة 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساعة واحدة قبل ترنسفكأيشن ، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام كاملة جديدة لنمو الخلايا فينيكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب eppendorpf العقيمة ، والجمع بين 100 ميكروغرام من التعبئة والتغليف بناء الحمض النووي ، و 250 ميكرولتر من 0.5M CaCl 2 ، وضبط حجم النهائية إلى 500 ميكرولتر مع الماء المعقم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل باستخدام ماصة ، مزيج بقوة هذا الحل مع الشرطة الوطنية الهايتية 500 2X ميكرولتر في أنبوب البولي بروبلين 15mL </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح هذا الخليط للراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 8-10 دقائق. خلال هذا الوقت سوف يعجل النموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا ، بينما تراجع الحكمة يحوم المتوسط ​​لتوزيع الخليط بالتساوي في جميع أنحاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 37 ساعة لمدة 12 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، استبدال المتوسطة مع 8ml المتوسطة باء كاملة نمو الخلايا واعادة الخلايا الحاضنة 37 درجة مئوية. </li></ol> 3. إصابة تتنبه خلايا الطحال B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف إزالة الخلايا من فينيكس 48hr بعد transfection وتمرير طاف عبر مرشح 0.2 ميكرون لإزالة أي حطام خلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 مل من مزيج من الفيروسات التي تحتوي على طاف مع 3 مل من الخلايا B مفعلة مسبقا (كما في الخطوة 1). من أجل تعزيز امتصاص الخلايا الفيروسية ل، إضافة polybrene بتركيز نهائي من 16 ميكروغرام لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقائق حتى 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد زيادة ونقصان ، لاحتضان المزيد من 48-72 ساعة عند 37 درجة مئوية للسماح لنمو الخلايا وانتشارها. </li></ol> 4. تحليل التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عداد الكريات تدفق وتحليل الخلايا للتعبير عن سطح IgG1 B220 والسطحي. وجود IgG1 على سطح الخلايا يشير إلى أن فئة التوحد التحول قد حدث نتيجة لانقاذ ناجحة عبر تكامل فيروسات من الجين AID. </li></ol> 5. ممثل النتائج انقذت نجحنا في نقص عامل تنشيط بروتين نازعة أمين سيتيدين المستحثة (AID) من نقص - AID (AID / --) باستخدام الخلايا الليمفاوية B - تنبيغ فيروسات. باختصار ، ولدت لنا التعبير عن الفيروسات القهقرية المؤتلف AID الماوس (خادمة) البروتين transfecting الخلايا مع فينيكس PMX - GFP - خادمة 15-18. وكانت المصابة بالفيروسات التي تحصد في خلايا B - AID ناقصة تم الحصول عليها من المساعدات الفئران التي تعاني من نقص في الصف خارج الحي تأشب التبديل (CSR) شروط التحفيز 19. ثم تم تحليل الخلايا المصابة ب المسؤولية الاجتماعية للشركات لIgG1 بعد 72hrs في الثقافة باستخدام تحليل التدفق الخلوي. الشكل 2 يبين كشف IgG1 على سطح الخلايا البائية مع مساعدات ولكن ليس بناء فارغ ، مشيرا إلى أن المسؤولية الاجتماعية للشركات قد حدث نتيجة لانقاذ التعبير AID. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : مخطط من التعبئة والتغليف فيروس داخل الخلايا المنتجة : تم subcloned الجينات في المصالح ، ويمثلها Ψ ، في PMX - IRES - GFP ، كما هو موضح سابقا 15. وكان transfected البلازميد الى ecotropic الفيروسية تغليف خط الخلية قادرة على انتاج هفوة بول والبروتين المغلف (فينيكس ، Orbigen) ، وذلك باستخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم 13 و 14. ثمان وأربعين ساعة بعد ترنسفكأيشن ، كان حصادها طاف الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على العدوى إلى خلايا الهدف الأساسي B تم الحصول عليها من الفئران. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : خلايا B AID منقوصة ، مع حفز CD40 المضادة للطائرات وأصيب IL - 4 مع الارتجاعي تحتوي PMX - خادمة GFP الارتجاعي أو التعبير عن GFP وحدها. كما تم تقييم مستوى المسؤولية الاجتماعية للشركات من خلال تحليل IgG1 FACS.

<ol>
	<li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function.">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li><li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+during+B+cell+development.">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells.">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li><li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Genetic Analysis. , (2000).</li><li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics.">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li><li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas.">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li><li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome.">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li><li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors.">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li><li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells.">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+potential+RNA+editing+enzyme.">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li><li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions.">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation.">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination.">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li><li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE:+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter.">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li><li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny.">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li><li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes:+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination.">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تنبيغ فيروسات من خلايا الطحال B كما هو موضح هنا ، وكما هو مبين في الشكل رقم 1 هو نهج الوراثية يمكن أن يكون مفيدا في دراسة الخلايا الليمفاوية B - لأن يتم التحكم في العديد من الفعاليات التنموية في lymphopoesis عن طريق التنظيم الترانسكربتي 1 و 2. في مراحل لاحقة من نض...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Atlanta Biologicals</td>
<td>S11550</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>22400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>20012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Blood Cell (RBC) lysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD43 beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B Cell Complete Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various components</td>
<td>Various Components</td>
<td>RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&mu;M &beta;-Mercaptoethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>IL-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>553787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>107689 &#x2028;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroquine diphosphate salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C6628</td>
<td>Used at 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Phoenix Eco cells (Murine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Orbigen</td>
<td>RVC-10002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-Cy5-&alpha;-mouse-CD45R (B220)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>15-0452-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-&alpha;-mouse-IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>A85-1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recombinant retroviral production and infection of b cells

التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا في الخلايا حقيقية النواة هي قوية نهج الجينية العكسية التي يتم التعبير عن الجينات في المصالح الخاضعة لسيطرة نظام تعبير مغايرة لتسهيل تحليل النمط الظاهري الناتج. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتعبير عن الجينات التي لا توجد عادة في الكائن الحي ، للتعبير عن شكل متحولة من منتج الجين ، أو المبالغة في التعبير عن الشكل السائد السلبية للمنتج الجين. انها مفيدة بشكل خاص في دراسة النظام hematopoetic حيث التنظيم الترانسكربتي آلية رقابية كبرى في تطوير وتمايز الخلايا باء (1) ، واستعرض في 2-4. الماوس الوراثة هو أداة قوية لدراسة الجينات البشرية والأمراض. تحليل مقارن للفأرة والجينوم البشري يكشف حفظ تصاحب جيني في أكثر من 90 ٪ من الجينوم 5 ، وأيضا الكثير من التكنولوجيا المستخدمة في نماذج الماوس ينطبق على دراسة الجينات البشرية ، على سبيل المثال ، والاضطرابات الجينية واستبدال أليلية 6 ومع ذلك ، فإن إنشاء ماوس المعدلة وراثيا يتطلب قدرا كبيرا من الموارد الطبيعة على حد سواء المالية والتقنية. وقد بدأت عدة مشاريع لتجميع مكتبات ضرب سلالات الماوس (KOMP ، EUCOMM ، NorCOMM) أو الطفرات المستحثة سلالات (بتبريد) ، والتي تتطلب جهودا واسعة النطاق والتعاون 7. ولذلك ، فمن المستحسن أن أول دراسة على النمط الظاهري من الجين المطلوب في نموذج خلية ثقافة الخلايا الأولية قبل التقدم إلى نموذج الفأر. فيروسات الحمض النووي DNA يدمج المضيفة ، ويفضل أن يكون داخل أو بالقرب من وحدة النسخ أو الجزر CPG ، مما أدى إلى مستقر وراثية التعبير عن الجينات وتعبئتها من الفائدة بينما تجنب إسكات الترانسكربتي 8 9. وكتب بعد ذلك الجينات تحت سيطرة أحد المروجين فيروسات كفاءة عالية ، مما أدى إلى كفاءة عالية من النسخ وإنتاج البروتين. ولذلك ، يمكن استخدام التعبير فيروسات مع الخلايا التي يصعب transfect ، شريطة أن الخلايا في حالة نشطة خلال الانقسام. لأن ترد الجينات الهيكلية للفيروس داخل العبوة خط الخلية ، وناقلات التعبير المستخدم لاستنساخ الجينات في المصالح لا تحتوي على جينات الفيروس الهيكلية ، وكلاهما يلغي احتمال revertants الفيروسية ويزيد من سلامة العمل مع supernatants الفيروسية كما يتم إنتاج أي virions المعدية 10. هنا نقدم مشروع بروتوكول لإنتاج فيروسات المؤتلف والعدوى اللاحقة من الخلايا باء الطحال. بعد العزلة ، ويتم تحفيز الخلايا المستزرعة الطحال مع ث lymphokines المشتقة ومعاداة CD40 ، والذي يدفع إلى موجة عارمة من انتشار الخلايا والتمايز ب 11. هذا البروتوكول هو مثالي لدراسة الأحداث التي وقعت في وقت متأخر من تطوير خلايا B وتمايز ، حيث يتم عزل الخلايا البائية من الأحداث التالية الطحال hematopoetic الأولي ولكن قبل التحفيز مستضدي للحث على تمايز بلازماوي.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells at JoVE.com

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

نظام فعال لهيكل وتحليل وظيفة الجين في<em&gt; خارج الحي</emيوصف&gt; ثقافة الخلايا الليمفاوية B - الطحال. هذا الأسلوب يستفيد من المؤتلف إنتاج فيروسات في حر مساعد ، ecotrophic تغليف خط الخلية. مستقرة ، والموروثة التعبير عن الجينات داخل الخلايا الليمفاوية من الفائدة الأساسي هو تحقيق تؤدي إلى توليد أجسام مضادة على سطح الخلايا البائية تمر فئة التوحد التبديل.

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

recombinant-retroviral-production-and-infection-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.0K Views.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. نظام فعال لهيكل وتحليل وظيفة الجين في خارج الحي ثقافة الخلايا الليمفاوية B - الطحال. هذا الأسلوب يستفيد من المؤتلف إنتاج فيروسات في حر مساعد ، ecotrophic تغليف خط الخلية. مستقرة ، والموروثة التعبير عن الجينات داخل الخلايا الليمفاوية من الفائدة الأساسي هو ...

Video: Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally infected chimpanzees, most in vitro models require several hundreds to thousands of viral genomes per cell in order to initiate a transient infection. Additionally, static 2D cultures of primary human hepatocytes (PHH) allow only short-term studies due to their rapid dedifferentiation. Here, we describe 3D liver-on-a-chip cultures of PHH, either in monocultures or in cocultures with other nonparenchymal liver-resident cells. These offer a significant improvement to studying long-term HBV infections with physiological host cell responses. In addition to facilitating drug efficacy studies, toxicological analysis, and investigations into pathogenesis, these microfluidic culture systems enable the evaluation of curative therapies for HBV infection aimed at eliminating covalently closed, circular (ccc)DNA. This presented method describes the set-up of PHH monocultures and PHH/Kupffer cell co-cultures, their infection with purified HBV, and the analysis of host responses. This method is particularly applicable to the evaluation of long-term effects of HBV infection, treatment combinations, and pathogenesis.

&quot;Liver-on-a-Chip&quot; Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

The goal of this protocol is to provide a step-by-step guide to perform 3-D &#34;liver-on-a-chip&#34; infection experiments with the hepatitis B virus.

الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide further insight on cell function. B-1a cells are a unique B cell subset in mice that produce protective natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes that arise during health and disease. B-1a cell IgM production differs depending on B-1a cell location, and therefore it becomes useful from a therapeutic standpoint to target B-1a localization to niches supportive of high antibody production. Here we describe a method to target B-1a cell migration to the bone marrow by retroviral-mediated overexpression of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4). Gene induction in primary murine B cells can be challenging and typically yields low transfection efficiencies of 10-20% depending on technique. Here we demonstrate that retroviral transduction of primary murine B-1a cells results in 30-40% transduction efficiency. This method utilizes adoptive cell transfer of transduced B-1a cells into B cell-deficient recipient mice so that donor B-1a cell migration and localization can be visualized. This protocol can be modified for other retroviral constructs and can be used in diverse functional assays post-adoptive transfer, including analysis of donor cell or host cell phenotype and function, or analysis of soluble factors secreted post B-1a cell transfer. The use of distinct donor and recipient mice differentiated by CD45.1 and CD45.2 allotype and the presence of a GFP reporter within the retroviral plasmid could also enable detection of donor cells in other, immune-sufficient mouse models containing endogenous B cell populations.

Here we describe a method for retroviral overexpression and adoptive transfer of murine B-1a cells to examine in vivo B-1a cell migration and localization. This protocol can be extended for diverse downstream functional assays including quantification of donor B-1a cell localization or analysis of donor cell-derived secreted factors post-adoptive transfer.

الرجعية Overexpression من CXCR4 على الخلايا B-1a مورين والنقل بالتبني للهجرة الخلايا B-1a المستهدفة إلى نخاع العظام وإنتاج IgM

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...