بدعم من JDRF ، المعاهد الوطنية للصحة (R01 - DK081469) ، ورابطة ولاية بنسلفانيا (مركز للتميز في الطب التجديدي منح 4100043362) ، ومارس من الدايمات (باسل أوكونور الباحث العلمي من بحوث جائزة كاتب) ، وجامعة ولاية بنسلفانيا التجريبية DERC ومنح جدوى (DK19525).

<ol>
	<li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+regeneration+of+adult+Beta+cells+does+not+involve+specialized+progenitors.">Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors.</a> Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).</li><li>Kiel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+do+not+asymmetrically+segregate+chromosomes+or+retain+BrdU.">Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU.</a> Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).</li><li>Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin1/ErbB4+signaling+induces+cardiomyocyte+proliferation+and+repair+of+heart+injury.">Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury.</a> Cell. 138, 257-257 (2009).</li><li>Rankin, M. M., Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Beta+Cell+Proliferation+Is+Severely+Restricted+with+Advanced+Age.">Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age.</a> Diabetes. , (2009).</li><li>He, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+Protein+Stability+Is+Regulated+in+Pancreatic+Beta+Cells.">Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells.</a> Mol Endocrinol. , (2009).</li><li>Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+growth:+an+unusual+paradigm+of+organogenesis+that+is+cyclin+D2/Cdk4+dependent.">Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent.</a> Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).</li><li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+slow+turnover+of+beta-cells+in+aged+adult+mice.">Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice.</a> Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).</li><li>Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dexamethasone+and+5-bromodeoxyuridine+on+protein+synthesis+and+secretion+during+in+vitro+pancreatic+development.">Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development.</a> Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).</li><li>Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-bromodeoxyuridine+may+alter+the+differentiative+program+of+the+embryonic+pancreas.">5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas.</a> J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).</li><li>Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+5-bromodeoxyuridine+inhibition+of+exocrine+pancreas+differentiation.">On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation.</a> J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).</li><li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+pancreatic+islet+cell+proliferation+by+heavy+water+labeling.">Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+and+bioorthogonal+reactions:+unprecedented+selectivity+in+the+labeling+of+biological+molecules.">Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules.</a> Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).</li><li>Buck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).</li><li>Huising, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRFR1+is+expressed+on+pancreatic+beta+cells,+promotes+beta+cell+proliferation,+and+potentiates+insulin+secretion+in+a+glucose-dependent+manner.">CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).</li><li>Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).</li><li>Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ordered+architecture+of+murine+ear+epidermis+is+maintained+by+progenitor+cells+with+random+fate.">The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate.</a> Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).</li></ol>

أجريت جميع التجارب على الفئران في منشأة الحيوان في مستشفى الاطفال في فيلادلفيا وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC).

نهجنا في ثيميدين النهج القائم على وضع العلامات دوران الخلية والعديد من التطبيقات المحتملة في مجال البحوث الطبية الحيوية. حتى الآن ، فقد ركزنا على البنكرياس ، ولكن علينا أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لدراسة دوران خلية من خلايا الجلد والأمعاء والكبد والكلى الغدة الكظرية ، والخصية والمبيض والغدة الدرقية والعقدة الليمفاوية ، تكون الدم والمخ 1. لأن دوران الخلية يختلف من الأنسجة إلى الأنسجة ، ينبغي وضع العلامات المخصصة استراتيجيات للحصول على المعلومات الأكثر إلحاحا من الجهاز من الفائدة. تستخدم موريسون وزملاؤه CldU وإيدو : 1 كل يوم لتسمية تكون الدم 2. كوهن وزملاؤه استخدام CldU وإيدو لمدة 4 أيام للكشف عن كل انقسام الخلايا في عضلة القلب تجديد 3. في المقابل ، فقد استخدمنا CldU وإيدو لمدة تصل إلى 9 أشهر لتسمية القاعدية إجمالي قيمة التداول داخل الخلية جزيرات البنكرياس ، والأنسجة مع دوران الخلية والحد الأدنى للأعمار الحيوانات 1،4-6. التطبيق الأكثر وضوحا المحتملة لوضع العلامات لدينا استراتيجية لدراسات لتحديد معدل دوران خلية ضمن توازن الأنسجة. ولكن لدينا التقنية لديها العديد من التطبيقات الأخرى المحتملة. على سبيل المثال ، فإننا أيضا تطبيق هذه التقنية في الآونة الأخيرة لتحديد التحول أنكجنيك داخل أنسجة ، حيث يمكن تكراره في مجالات التركيز زيادة التعرف بسهولة من قبل التأسيس أو زيادة CldU إيدو 5. تستخدم موريسون وزملاؤه CldU وإيدو : 1 كل يوم لاختبار سلوك الاحتفاظ التسمية من الخلايا الجذعية المكونة للدم 2. لقد طبقنا أيضا وضع العلامات التماثلية ثيميدين متتابعة لتحديد ما إذا كان العبور تضخيم الخلايا تساهم في النمو أو تجديد الأنسجة 1. في هذه الادارة تطبيق متتابعة من نظائرها ثيميدين يمثل نهجا جديدا لدراسة أصول وبقاء الخلايا المشاركة في توازن الأنسجة. لا ينبغي أن تستخدم نظائرها ثيميدين دون الحذر. نظائرها ثيميدين الاصطناعية والسميات المحتملة لتقسيم الخلايا ، واستخدامها من الناحية النظرية يمكن أن تؤثر في الحيوانات دوران الخلية المتنامية. وقد استخدمت ونظائرها ثيميدين radiosensitizing كلاء لمرضى السرطان ، وبطء دوران قد الخلية. وبالتالي فإننا نحث المحققين للتحقيق بحذر عن السميات المحتملة في الأنسجة اهتمامهم. على سبيل المثال ، Trumpp والزملاء وجدت أن BrdU الجهازية يمكن أن تجبر الخلايا الجذعية المكونة للدم لدخول دورة الخلية 7. على سبيل المثال ، لاحظ روتر وزملاؤه أن ارتفاع نظائرها ثيميدين جرعة سامة لتطوير البنكرياس 8. في الآونة الأخيرة هيلرشتاين وزملاؤه في KineMed ، وجدت أن شركة BrdU الادارة تبطئ داخل جزيرة الانتشار 16-25 ٪ باستخدام ملكية العلامات تقنية المياه الثقيلة 9. تضمنت استعدادات الجزيرة كلها التي يستخدمها هيلرشتاين وزملاؤه الغدد الصماء وغيرها من أنواع الخلايا غير الغدد الصماء ، والتي قد تشمل ما يصل الى 50 ٪ من مجموع الاستعدادات جزيرة. ومع ذلك ، نجد أن التسريب المطول للBrdU لا تؤثر على تكاثر الخلايا بيتا في الفئران البالغين الشباب ، كما تقاس ki67 التعبير 4. وبالمثل ، على المدى الطويل وإدارة CldU إيدو لا يبدو أن يضعف بيتا التوسع الشامل الخلية 1. وعلاوة على ذلك ، بيتا معدلات تكاثر الخلايا وتعادل بين الفئران في المسمى مع BrdU لفترات طويلة من الزمن والفئران التي وصفت فقط لبضع ساعات (تم تطبيع أسعار الفائدة لفترات زمنية ما يعادلها). معا ، وهذه النتائج تشير إلى أن الفئران يمكن أن يتسامح مع بأمان على المدى الطويل جرعة منخفضة من إدارة ثيميدين نظائرها. لا يزال ، لا يمكننا أن نستبعد السمية المحتملة من قبل نظائرها ثيميدين بيتا في البنكرياس في نمو الخلايا. نتيجة لذلك ، نواصل تنفيذ الضوابط عندما وسم الفئران مع نظائرها ثيميدين ، ونحث محققين آخرين على القيام بذلك أيضا. لدينا أسلوب متسلسل ثيميدين العلامات التماثلية لا يخلو من العثرات والتحديات التقنية. ونتيجة لذلك ، والشرائح السيطرة ذات أهمية خاصة. لقد ولدت لنا السيطرة الشرائح التي تتكون من أنسجة مختلفة من 1) الفئران التي وصفت فقط مع CldU ؛. 2) الفئران التي وصفت فقط مع إيدو ؛ 3) الفئران التي وصفت بالتتابع مع CldU ثم تعاطي المخدرات بالحقن ؛ 4) الفئران التي وصفت بالتسلسل في ترتيب عكسي ، أولا مع إيدو وCldU ثم ؛ 5) الفئران التي هي وهمية المسمى مع الماء فقط. عندما تعلم أن التسمية مع CldU وإيدو ، وينبغي للمحققين يحمل دائما خارج البروتوكول كامل مع جميع مجموعات من الشرائح 5 أعلاه من الأنسجة من الاهتمام. عبر التفاعل في ما بين طفيفة وCldU إيدو هو مؤسف لكن لا مفر منه الجانب السلبي لوضع العلامات على حد سواء مع نظائرها ثيميدين. وتستند هذه التقنية على إيدو CldU والاختلافات في الانتماءات في ما بين أمصال مضادة التي كانت مستمدة في الأصل ضد BrdU في الأنواع المختلفة (الفأر والفئران). بروتوكول لدينا ، في حين مرهقة ، يهدف الى تقليل التفاعل عبر هذا القبيل. وبالتالي ، فإننا نحث الحذر في أوساط المحققين الذين يعتبرون تخطي الخطوة (ق) من البروتوكول. على وجه الخصوص ، لديناواجه مشاكل مع أمصال مضادة الثانوية التي يتم التفاعل المتبادل في ما بين الفأر والفئران. يمكن التقليل من ذلك عن طريق استخدام الأمصال الضدية جاكسون التي يتم بالكامل عبر كثف في ما بين الفأر والفئران. فشلنا في بعض الأحيان بشكل كاف للكشف عن دمج ثيميدين. في مثل هذه الحالات من المهم جدا لاستخدام الشرائح مراقبة إيجابية لتحديد أي خطوة أو كاشف لم يكن يعمل. الصعوبات التي عادة ما تكون بسبب سوء aliquots أمصال مضادة ، والشرائح الجاف ، أو permeabilization النووية غير كافية. لقد فشلنا في تسمية بنجاح الأجنة النامية مع إيدو. وبالتالي ، قد لا تكون قابلة للاختراق جميع الأنسجة لإيدو. بدائل لCldU وإيدو لمضاعفة العلامات التماثلية ثيميدين تلوح في الأفق. يمكن ايدو (5 - استراديول deoxyuridine - 2) تكون ركيزة لحفز النحاس فوق الكشف الكيمياء 10،11. طرق الكشف ايدو لا تتطلب الفصل بين حمض النووي ، وبالتالي فهي قابلة للغاية لتحليل التدفق الخلوي بنسبة 12. EDU متوافق ولكن ليس عبر التفاعل مع BrdU 10. وقد استخدمت لقياس دوران ايدو الخلايا والأنسجة المختلفة بما في ذلك الماوس خلايا بيتا في البنكرياس 13 ، L الخلايا المعوية 14 و 15 البشرة. ايدو هي مكلفة نوعا ما في لحظة (1000 دولار امريكى لكل 500mg). لا تزال وايدو ويبدو أن الكشف عن أكثر حساسية من الكشف BrdU 10. وبالتالي ، قد يكون من المجدي اقتصاديا للجمع بين ايدو وBrdU بدلا من CldU وإيدو. هذا الأسلوب قد تسمح أيضا للكشف عن ثلاث جولات مختلفة من انقسام الخلايا في الفئران لثلاثة أسباب تسمية ايدو ، CldU ، وتعاطي المخدرات بالحقن. باختصار ، لدينا أسلوب متسلسل ثيميدين العلامات التماثلية هو نهج جديد للكشف عن دوران الخلية. نأمل نهجنا تمكن علماء آخرون على نحو أكثر دقة تحديد انقسام الخلايا ، ونتوقع أن تفتح نماذج جديدة في توازن الأنسجة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

القياس الدقيق للانقسام الخلية هو التحدي الأساسي في مجال البيولوجيا التجريبية التي تزداد تعقيدا عندما يصبح يتم تحليل الخلايا ببطء الانقسام. الوسائل المتبعة للكشف عن انقسام الخلايا وتشمل التصور المجهري المباشر المستمر في الثقافة الخلية ، التخفيف من الأصباغ حيوية مثل succinimidyl carboxyfluorescein استر دى aetate (CFSE) ، المناعية كشف المستضدات مولد للتفتل مثل ki67 أو PCNA ، ونظائرها ثيميدين. ويمكن الكشف عن نظائرها ثيميدين جانب مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك الكشف عن الراديو لثيميدين معالج بالتريتيوم ، المناعية الكشف عن برومو deoxyuridine (BrdU) ، اللون الأخضر deoxyuridine (CldU) وiodo deoxyuridine - (إيدو) ، والكشف عن المواد الكيميائية لdeoxyuridine - استراديول (ايدو). وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين مختلفة (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة. لدينا وسيلة تسمح للمحققين لتحديد بدقة جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. عن طريق تحسين بروتوكولات immunostaining يمكن الكشف عن نهجنا منخفضة جدا نظائرها ثيميدين الجرعة المعطاة عن طريق مياه الشرب ، وآمنة لإدارة مجموعة من الفئران لفترات طويلة من الزمن. وبالتالي ، يمكن استخدام التقنية لدينا لكشف الخلية في الأنسجة دوران جدا طويلة الأمد. ويمكن تحقيق النتائج المثلى تلطيخ immunofluoresent في أنواع الأنسجة المتعددة ، بما في ذلك البنكرياس والجلد والأمعاء والكبد والغدة الكظرية والخصية والمبيض والغدة الدرقية والعقدة اللمفاوية ، والدماغ. لقد طبقنا هذه التقنية أيضا لتحديد التحول أنكجنيك داخل الأنسجة. لقد طبقنا مزيد من هذه التقنية لتحديد ما إذا كان العبور تضخيم الخلايا تساهم في النمو أو تجديد الأنسجة. في هذا المعنى ، ادارة متسلسلة من نظائرها ثيميدين يمثل نهجا جديدا لدراسة أصول وبقاء الخلايا المشاركة في توازن الأنسجة.

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue at JoVE.com

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة لتحديد جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. هذه الاستراتيجية مفيدة للكشف عن دوران خلية من خلايا أنسجة طويلة الأمد ، والتحول أنكجنيك أو خلايا العبور تضخيم.

مناعي الكشف عن النظائر ثيميدين الثاني (CldU وإيدو) في الأنسجة الابتدائية

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.4K Views.  University of Pennsylvania-School of Medicine. وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة لتحديد جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. هذه الاستراتيجية مفيدة للكشف عن دوران خلية من خلايا أنسجة طويلة الأمد ، والتحول أنكجنيك أو خلايا العبور تضخيم.

Video: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

جمع الانسجه من الخفافيش للتحليلات الomics وثقافة الخلايا الاوليه

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

الحث المبرمج والكشف في الثقافة الاساسيه للخلايا المعوية الخيار البحر

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

اكتشاف بسيط من سيليا الأولية من قبل المناعةfluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

سير العمل البروتيومي الكمي باستخدام رصد التفاعل المتعدد القائم على الكشف عن البروتينات من أنسجة الدماغ البشري

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

وضع العلامات المناعية للفيروسات النباتية وبروتينات ناقلات الحشرات في الأمعاء النصفية

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...