JDRF、NIH（R01 - DK081469）、ペンシルベニア州の連邦（再生医療助成4100043362の卓越性のためのセンター）、ダイムの月（バジルオコナースターター学者研究賞）、およびペンシルベニア州DERCパイロットの大学でサポートさと実現可能性の付与（DK19525）。

1。 CldUとIDUとラベリング組織<ol><li>水のチミジン類似体（CldUまたはIDU）を溶かす。各化学物質1mgの/ mLを量り、蒸留水のガラスびんを分離するために追加。我々は通常、一度に各1リットルを用意。 </li><li>攪拌プレートや攪拌機の他のフォーム上に化学物質を溶解する。 CldUは10分で溶解します。室温での撹拌。 IDUは37℃撹拌の時間°シェーカーでC以上のものが必要です。水源は、IDUの溶解性に影響を与えることができます。 IDUは一晩振とうした後、一時停止解除のままの場合、水のきれいなソースを試してみてください。溶液は4暗所で℃で保存されています。 </li><li>希望の標識期間のためのマウスへの最初のチミジンを含む溶液を（CldUまたはIDUのどちらか）を管理する。マウスは、ラベルの期間中にラベルのない水へのアクセスを許可しないでください。指定された標識期間が完了すると、少なくとも24時間の未標識の水で洗い流して（類似物を含むチミジンは数時間の血清半減期を持っている）を開始。希望の標識期間のためのマウスへの2番目のチミジンを含む溶液を（CldUまたはIDUのどちらか）を管理する。定期的に補充する水はボトル脱水を防ぐために！ </li><li>また、マウスはCdlUし、IDUのシーケンシャル腹腔内注射によって標識することができる。 10mgの/ mLの濃度でCldUまたはIDUを準備します。 IDUは、懸濁液中に行って激しく振盪続いて、濃水酸化ナトリウム溶液の滴下加算が必要になる場合があります。過剰の水酸化ナトリウムを追加しないでください。 IDUの10mLの溶液に水酸化ナトリウムの一滴で37攪拌の時間が続く°シェーカーにCを追加。ないソリューションの場合、水酸化ナトリウムの添加を繰り返す。腹腔内のスペースにgの体重あたり100mcgを注入する。 </li><li>コントロールスライドは、このプロトコルのために不可欠です。その結果、我々は強く、研究者が、感度と特異性を確保するためのチミジンアナログラベルのいくつかのバリエーションを行うお勧めします。これらは、1を含める必要があります。のみCldUで標識したマウス、2。唯一のIDUで標識したマウス、3。順次CldUし、IDUで標識したマウス、4。順次IDUとしCldUで最初、逆の順序で標識したマウス;水だけで標識されたモックな5匹。 CldUとIDUとラベルに学習するときに、捜査官は常に関心の組織からのコントロールスライドの全5上記のセットとプロトコル全体を行うべきである。 </li></ol> 2。組織の収穫、固定、およびスライドの準備<ol><li>適切な麻酔薬を使用して、致命的な過剰摂取を実行してから放血を経由してマウスを生け贄に捧げる。新鮮な組織を切除すると24時間4℃で4％paraformalehyde ° Cで固定する。埋め込み用に4℃で1時04分ホルマリンバッファーとストア° Cに組織を移す。 </li><li>また、血液が体内から消去されるまで生理食塩水と左心室を経由してマウスを灌流して致命的な過剰摂取を実行し、その後直ちに4％パラホルムアルデヒドの30〜50 ccで灌流。埋め込むために4℃で1：04ホルマリン緩衝液での関心や店舗の組織を削除します。 </li><li>組織の脱水とパラフィン包埋した後、5ミクロンの組織切片と充電スライド上で場所をカット。 ℃で16時間（下記の抗原の検索の手順と本質的な）スライドに組織の接着性を確保するために65でスライドを焼く。 </li></ol> 3。脱水、透過処理、およびAntigen検索<ol><li> 5分、2つのキシレン槽にスライドを浸漬することにより過剰なパラフィンを取り除く。それぞれ。 </li><li> 100、95、90、80 70、50％：水で希釈したエタノールにスライドを浸漬することにより組織を再水和。 3分間スライドを浸す。各濃度で、100％で始まり、最終的な浸漬では50％に向かって行く。 </li><li> 5分間スライドを洗浄する。 1X PBSインチ</li><li> 5分（新鮮毎回製）の0.2％のTriton - X溶液中にスライドを浸漬することにより細胞を透過処理。 </li><li>マイクロ波組織の抗原賦活化のためのスライドを準備します。ソリューションは、蒸発損失を考慮してスライドの上部より5センチメートルを覆うように、十分なボリューム0.01M pH6.0のクエン酸ナトリウム緩衝液でガラスビーカーにスライドを配置。 </li><li>マイクロ波は、解決策が沸騰するまでスライド（3-10分。フルパワー時）。解決策が徐々に沸騰するまで、消費電力を削減（10〜80パーセント）とさらに20分間継続する。解決策が遅い沸騰のまま確保するために定期的にマイクロ波をチェックしてください。 </li><li>場所のビーカーは、ベンチトップでのスライドを含む、ゆっくりと室温、（約2時間）まで冷却することができます。 </li><li>スライドは、温度計を用いて室温にいることを確認。 </li><li> 40分間1.5N HCLにスライドを浸し。室温で。 </li><li>ウォッシュは、1 × PBS、5分で二回スライド。洗浄ごと。 </li></ol> 4。一次と二次抗体<ol><li>それは、スライドは、プロトコル全体を通して非常に湿ったままであることが重要です。乾燥した組織は、はるかに自動になります蛍光、結果として得られる画像が使用できなくなっています。死ぬ防ぐために、一度に一つのスライドを処理する。 </li><li>サークル（すなわち、ワックス）ペンをブロックする液体とスライド上の各セクション。 1 × PBSの容器に戻しスライドを置きます。 </li><li>ウェットペーパータオルを置くことによって湿度の高いインキュベーションチャンバーを作ることは密閉プラスチック容器の底に平らに置いた。 </li><li> 1 × PBSで希釈した10％ロバ血清のブロッキング溶液を作る。完全なソリューションと各セクションをカバーすることが重要です。 1 × 1.5センチメートルの組織切片の場合は、セクションごとに溶液50​​マイクロリットルで十分です。 </li><li>スライドのブロッキング溶液を追加。 1X PBSからスライドを外し、ゆっくりと乾燥したペーパータオルのスタック上にスライドの端をタップすることで、余分な液体を取り除く。場所は、インキュベーション室内のスライドと各セクションに10％ブロック溶液50マイクロリットルを追加してください。すべてのスライドを室温で1時間近くにコンテナとインキュベートを完了している場合。 </li><li> IDUを検出する一次抗体の希釈を準備します。 1 × PBSで行われた5％ロバ血清で1:250の濃度でマウス抗BrdUを希釈する。スライドからブロックのソリューションをオフにタップして、インキュベーション室に戻って置きます。各セクションに、上記の一次抗体を追加し、4℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>高ストリンジェンシー洗浄を（CldUにマウス抗BrdU抗血清によって結合を最小限にする）準備。新鮮な低塩TBST緩衝液（; pH8.0の36mmのトリス、50mmの塩化ナトリウム、0.5％Tween - 20を）作る。あなたは、スライドのペアごとにバッファー40mLのが必要になります。各50 mLコニカルチューブにバッファーを40 mLを加え。スライドを追加する前に、37〜予熱解決策は、℃の</li><li>一度に二人は、、インキュベーションチャンバーからスライドを削除する（組織サンプルが互いに離れて向くように）バックツーバックに配置して、過剰な一次抗体をオフにタップします。低塩TBSTとカバーで満たされたチューブにスライドを配置。 20分間チューブを振とうする。 37℃の温度で細菌培養インキュベーターを振っ° C、および225 rpmに設定した速度インチ</li><li>スライドを新鮮な1X PBSで2回洗浄する。 5分。洗浄ごと。 </li><li>必要に応じて、CldUと組織抗原の検出のために次の一次抗体溶液を準備します。 1 × PBSで行われた5％ロバ血清で1:250の濃度でラット抗BrdUを希釈する。一次抗体溶液に濃度を作業で組織の抗原に対する一次抗血清を希釈する。 </li><li>スライドの過剰1X PBSをオフにタップし、そしてインキュベーション室に置いてください。各セクションに一次抗体を加え、4℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>スライドを新鮮な1X PBSで2回洗浄する。 5分。洗浄ごと。 </li><li>二次抗体溶液を準備します。 Cy2とロバ抗ラット1:250へとCy5ロバ抗マウス、5％ロバ血清を含む1X PBS溶液で1:500に希釈してください。組織の抗原抗血清の主な種を検出するためのCy3二次追加。また、二次抗体溶液で1:150にDAPI mLの/ 0.4mgストック溶液を希釈する。 </li><li>スライドとインキュベーションチャンバー内の場所を過剰1X PBSをオフにタップします。各セクションに二次抗体溶液を追加し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>スライドを新鮮な1X PBSで2回洗浄する。 5分。洗浄ごと。 </li><li>スライドの過剰1X PBSオフをタップして、ゴールドアンチフェードマウントメディアを（dyanine色素でVectashieldを使用しないでください！）延長するとカバーガラスを付着する。気泡を除去するためにカバースリップを押してください。 4℃で保存します。 </li></ol> 5。イメージングと解析<ol><li>高エネルギー光源、プラン - アポクロマート対物レンズ、および高効率の顕微鏡のカメラ（例えば浜松ホトニクスオルカER）を装備した蛍光顕微鏡画像の関心の組織を。 AMCA（DAPI）、Cy2と（CldU）、Cy3標識（組織抗原）、およびCy5（IDU）のチャンネルで画像をキャプチャ。単一のマルチレイヤーイメージファイルを作成するために画像をマージ。 </li><li>正しく実行した場合、DAPI染色された核が均一に明るくなります。組織の抗原（例えばインシュリン）目的の細胞を明らかにする必要があります。 DAPIまたは組織抗原を染色する場合は、カバーガラスを除去し、二次抗血清のアプリケーションを繰り返すために一晩1X PBSで弱いまたは一貫性のない、没頭スライドです。 </li><li> Cy3での組織の抗原に焦点を当てる。チャンネル間の切り替え、Cy2ととCy5チャネルでCldUとIDUの染色を確認してください。として過度のIDUとCldU共同陽性によって示されるマーカー、間の潜在的な交差反応性を探します。のみCldUまたはIDUを含む組織を探します。 CldUまたはIDU陽性核の欠如は、ラベルや染色技術的な問題を示している可能性があります。このケースでは、高度に複製組織（例えば、リンパ節）を探します。 </li><li>画像を分析する。 DAPIと組織の抗原を含むレイヤーを表示します。利き手でのホワイトボードマーカーと非利き手におけるセルカウンタを使用して、ドライ消去マーカー（別名ホワイトボードのマーカー）と対照的なマークで、各核をマーク。興味の組織内でDAPI陽性細胞をカウント。総細胞数を記録します。マークを削除するには、乾燥した消しゴムを使用してください。レイヤーを表示するDAPI、組織の抗原、およびCldUを含むの。興味の組織内でCldU陽性細胞をカウント。記録CldU細胞数がマークを消去しないでください。組織抗原、CldU、およびIDUを含むレイヤを可視化する表示に変更。 CldU IDU二重陽性細胞をカウント。レコードの値は、すべてのマークを消去し、DAPI、組織の抗原、およびIDUが含まれる画層が表示されます。興味の組織内でIDUの陽性細胞の総数を数えます。 IDUの細胞数を記録します。 </li></ol> 6。代表的な結果私たちは、順番に即時犠牲に続く二週間、のために一週間してから、IDUのためCldUで6週齢の雌マウスのラベルが付いた。膵臓はCldU、IDU、およびインスリン（組織抗原）だけでなく、DAPIを検出するために染色した。島は、一様にインスリンで染色した。 CldU染色された核は、IDU染色された核（図2）とは異なるであった。膵島の外に多くの核がCldU IDU共同陽性（図2、右下、白矢印）でした。単一のインスリン陽性細胞はCldUとIDU（図2、右下、マゼンタの矢印）の両方のための核染色を持っていた。 マウス。マウスを用いた全ての実験は、フィラデルフィアの小児病院のIACUC委員のガイドラインに従って行った。女性B6.129 F1野生型マウスは、PMIニュートリションインターナショナル（Richmond.インディアナ州）からフィラデルフィアの小児病院で実験動物施設で収容されたタコ（ジャーマンタウン、ニューヨーク）、、及び飼育マウス国会5015から購入した。 戦略のラベル付け。 CldU最初の細胞分裂のイベント（このスキームでは緑色のマーク）とIDU（この方式では赤マーク）で2番目の細胞分裂を標識することにより、CldUとIDU（緑/赤）の両方との共同で標識された細胞におけるシーケンシャル細胞分裂の結果。 マウス内の膵臓の細胞のターンオーバーのチミジン標識法の代表的な結果。中央のランゲルハンス島とマウスの膵臓の免疫蛍光像。マウスは、即時の犠牲の前に飲料水で2週間後、1週間やIDUに対してCldUで注入した。プロトコルで説明されているように膵臓のサンプルが処理されました。異なる層との組み合わせで最大40倍の目標の画像は、カウントに適して表示されます。マージされた画像はDAPI（白）CldU（緑）、IDU（赤）、インスリンを（黄色）が含まれています。 （上段、左）DAPIとインスリン。 （右上）CldUとインスリン。 （下、左）IDUとインスリン。 （下、右）CldU、IDU、およびインスリン。スケールバー：100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ラベリング戦略。 CldU最初の細胞分裂のイベント（このスキームでは緑色のマーク）とIDU（この方式では赤マーク）で2番目の細胞分裂を標識することにより、CldUとIDU（緑/赤）の両方との共同で標識された細胞におけるシーケンシャル細胞分裂の結果。 <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。マウス内の膵臓細胞のターンオーバーのチミジン標識の代表結果。中央のランゲルハンス島とマウスの膵臓の免疫蛍光像。マウスは、即時の犠牲の前に飲料水で2週間後、1週間やIDUに対してCldUで注入した。プロトコルで説明されているように膵臓のサンプルが処理されました。異なる層との組み合わせで最大40倍の目標の画像は、カウントに適して表示されます。マージされた画像はDAPI（白）CldU（緑）、IDU（赤）、インスリンを（黄色）が含まれています。 （上段、左）DAPIとインスリン。 （右上）CldUとインスリン。 （下、左）IDUとインスリン。 （下、右）CldU、IDU、およびインスリン。スケールバー：100μmの。

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ordered+architecture+of+murine+ear+epidermis+is+maintained+by+progenitor+cells+with+random+fate.">The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate.</a> Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).</li></ol>

マウスを用いた全ての実験は、動物実験のガイドラインによるとフィラデルフィアの小児病院での動物施設で行われ、委員会（IACUC）を使用していた。

細胞のターンオーバーをラベリングするチミジンベースのアプローチに我々のアプローチは、生物医学研究において多くの潜在的なアプリケーションを持っています。これまでに、我々は、膵臓に集中しているが、我々はまた、細胞の皮膚のターンオーバー、腸、肝臓、副腎、腎臓、精巣、卵巣、甲状腺、リンパ節、造血、および脳1を調べるには、この戦略を適用している。細胞のターンオーバーは、組織から組織に変化するので、ラベルの戦略は、関心の臓器からの最も魅力的な情報を得るためにカスタマイズする必要があります。モリソンらは、1日各造血2をラベル付けするためのCldUとIDUを使用。クーンらは、再生させる心筋3で細胞分裂を検出するために各4日間CldUとIDUを使用してください。対照的に、我々は最高の動物の年齢1,4-6など、最小限の細胞の入れ替えに膵島within基底細胞のターンオーバー、組織にラベルを付けるために合計9ヶ月までCldUとIdUを使用しています。研究は組織の恒常性の中で細胞のターンオーバーを定義するための私達のラベリング方式の最も明らかな潜在的なアプリケーションです。しかし、我々の手法にはいくつかの他の潜在的なアプリケーションを持っています。例えば、我々はまた、最近増加複製の焦点領域が容易にCldUまたはIDU 5の増加取り込みによって識別することができる組織内の発癌性形質転換を、識別するためにこのテクニックを適用する。モリソンらは、造血幹細胞の挙動2を保持するラベルをテストするために各1日CldUとIDUを使用。我々はまた、トランジット増幅細胞が組織1の成長または更新に貢献するかどうかを判断するためにシーケンシャルチミジンのアナログのラベルを適用している。このアプリケーションではチミジンの類似体の連続投与は、組織の恒常性に関与する細胞の起源と生存を研究するための斬新なアプローチを表しています。 チミジン類似体は注意せずに使用すべきではない。合成チミジン類似体は、分裂細胞​​への潜在的な毒性を持って、それらを使用すると理論的に成長している動物の細胞のターンオーバーを損なう可能性があります。チミジン類似体は、がん患者のための放射線増感剤として使用されており、細胞のターンオーバーが遅くなることがあります。したがって、我々は慎重に関心を持つ組織の潜在的な毒性のために調査する研究者を強くお勧めします。例えば、Trumppらは、全身のBrdUは造血幹細胞が細胞周期7を入力するように強制することができますを見つける。例えば、ラターらは、高用量のチミジンの類似体は膵臓8を開発するに有毒であることを観察した。最近になってKineMedでHellersteinと同僚は、株式会社はBrdU投与が独自の重水標識法9を使用して16から25パーセントによって内膵島の増殖が遅くなることがわかった。 Hellersteinと同僚によって使用される全膵島の準備は合計膵島製剤の50％程度を構成することができる他の多くの内分泌および非内分泌細胞型を含んでいた。しかし、我々はBrdUのその長時間注入がki67式4により測定される、若い成体マウスのβ細胞の増殖には影響しない見つける。同様に、CldUとIDUの長期投与は、β細胞量の拡大1を損なうしていないようだ。さらに、β細胞の増殖速度は時間とほんの数時間（速度が同等の期間に正規化されている）のためにラベルが付いているマウスの長時間のBrdUで標識されたマウスとの間で等価です。一緒に、これらの結果は、マウスが安全にチミジン類似体の長期的な低用量投与に耐えることができることを示唆している。それでも、我々は、膵β細胞増殖のチミジン類似体による潜在的な毒性を除外することはできない。その結果、我々は、チミジン類似体をマウスにラベルを付ける際にコントロールを行う、などなどうまくやって他の研究を促す続ける。 シーケンシャルチミジンのアナログラベリングの私たちの技術は、落とし穴や技術的課題がないわけではない。その結果、コントロールのスライドは、特に重要です。私達は1から様々な組織で構成される制御スライドを生成している）のみCldUで標識されたマウスは、2）のみIDUで標識されたマウスは、3）を順次CldUし、IDUで標識されたマウスは、4）。 IDUとしCldUを持つ最初の順番に逆の順序で標識したマウス、、5）水だけで標識されたモックれているマウス。。 CldUとIDUとラベルに学習するときに、捜査官は常に関心の組織からのスライドの全5上記のセットとプロトコル全体を行うべきである。 CldUとIDUの間で若干の交差反応性は、両方のチミジン類似体で標識するために不幸が避けられない欠点です。 CldUとIDUは元々別の種（マウス、ラット）でのBrdUに対して誘導された抗血清との間の親和性の違いに基づいています。我々のプロトコルは、面倒な一方、そのような交差反応性を最小限に抑えるように設計されています。その結果、我々は、プロトコールのステップ（複数可）をスキップ考慮調査官の間で注意を促す。特に、我々は持っているマウスとラットの間に交差反応性である二次抗血清との問題が発生しました。これは完全にマウスとラットの間でクロス吸着されているジャクソンの抗血清を使用して最小化することができます。 我々は時折適切にチミジン取り込みを検出するために失敗する。このような場合では、試薬やステップが正常に機能していないかを判断するための陽性コントロールスライドを使用することは極めて重要です。困難は、一般的に抗血清、乾燥したスライド、または不十分な核膜透過性の悪いアリコートによるものです。私たちは正常にIDUと胚を開発するラベルを付けるために失敗している。したがって、すべての組織は、IDUへの透過性があります。 ダブルチミジンのアナログ表示のためCldUとIDUへの代替が地平線上にあります。 EDU（5 -エチニル-2 -デオキシウリジン）は、銅触媒のクリックケミストリー検出10,11用基板とすることができます。 EDUの検出方法は、DNA鎖の分離を必要とし、フローサイトメトリー12でこのような分析に非常に適していることはありません。 EDUは互換性がありますが、BrdUを10で反応を越えることはありません。 EDUは、膵β細胞13、腸管のL細胞14と表皮15を含む様々なマウス組織の細胞のターンオーバーを定量化するために使用されています。 EDUは、瞬間（500mgの1000ドル米国）でかなり高価です。それでも、エドゥ検出は、BrdUの検出10よりもはるかに敏感であることが表示されます。従って、それは代わりにCldUとIDUのEDUとBrdUを組み合わせることが経済的に可能かもしれません。また、このメソッドは、三重EDU、CldU、およびIDUに対してラベル付けマウスの細胞分裂の3つの異なるラウンドの検出を許可することがあります。 要約すると、シーケンシャルチミジンのアナログラベリングの私たちの技術は、細胞のターンオーバーを検出するための新しいアプローチです。我々は我々のアプローチは、より正確に細胞分裂を定量化するために他の科学者を可能に願って、そしてそれは組織の恒常性に新たなパラダイムを開くことを期待しています。

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

細胞分裂の正確な測定は、徐々に分裂細胞を分析する場合、ますます複雑になると、実験生物学の基本的な課題です。細胞分裂を検出するために確立された方法は、細胞培養、このようなカルボキシフルオレセインジ - aetateスクシンイミジルエステル（CFSE）、などki67やPCNAなどの細胞分裂促進抗原の免疫検出などの重要な染料の希釈、およびチミジン類似体の連続的な顕微鏡で直接可視化が含まれています。チミジン類似体はトリチウム化チミジン、ブロモデオキシウリジン（BrdU）、クロロデオキシウリジン（CldU）とヨードデオキシウリジン（IDU）のための免疫検出、およびエチニルウリジンのための化学的検出のためのラジオ検出など、さまざまな方法で検出することができます（EDU）。我々は、成体マウスの組織内に別のチミジン類似体のシーケンシャル取り込み（CldUとIDU）を検出するための戦略を導出している。本手法は、研究者が正確に細胞分裂の2つの連続ラウンドを定量化することができます。最適化する免疫染色のプロトコルによって我々のアプローチは、長時間にわたってマウスに投与する安全な飲料水を介して投与する非常に低用量のチミジンアナログを検出することができます。その結果、私たちの技術は非常に長命の組織において細胞のターンオーバーを検出するために使用することができます。最適なimmunofluoresent染色の結果は、膵臓、皮膚、腸、肝臓、副腎、精巣、卵巣、甲状腺、リンパ節、および脳を含む複数の組織型、で達成することができます。我々はまた、組織内で発癌性形質転換を識別するためにこの手法を適用している。我々は、さらにトランジット増幅細胞は組織の成長や更新に貢献かどうかを判断するためにこの手法を適用している。この意味で、チミジン類似体の連続投与は、組織の恒常性に関与する細胞の起源と生存を研究するための斬新なアプローチを表しています。

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

我々は、細胞分裂の2つの連続ラウンドを定量化するために、成体マウスの組織へのチミジン類似体（CldUとIDU）のシーケンシャル取り込みを検出するための戦略を導出している。この戦略は、細胞の寿命の長い組織の売上高は、発癌性形質転換、またはトランジット増幅細胞を検出するのに便利です。

一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.5K ビュー.  University of Pennsylvania-School of Medicine. 我々は、細胞分裂の2つの連続ラウンドを定量化するために、成体マウスの組織へのチミジン類似体（CldUとIDU）のシーケンシャル取り込みを検出するための戦略を導出している。この戦略は、細胞の寿命の長い組織の売上高は、発癌性形質転換、またはトランジット増幅細胞を検出するのに便利です。

ビデオ: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

生物学

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

ナマコ腸細胞の一次培養におけるアポトーシス誘導と検出

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

半翅目腸内における植物ウイルスおよび昆虫ベクタータンパク質の免疫蛍光標識

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather changes, various pesticides, pathogens, and malnutrition, mainly entering through the mouth and primarily affecting the digestive tracts of adult bees. To understand and prevent the effects of such external and internal stressors on honeybees, one useful research method is the immunohistochemical method. A basic protocol is described to prepare the midgut (ventriculus) and hypopharyngeal glands (HPGs) of adult bees for histological analysis. A detailed methodology is described to assess the level of cell damage and distinguish necrosis from programmed cell death (apoptosis) as a natural process of tissue regeneration. The results of adult honeybee treatment with oxalic acid and pesticides (insecticide and acaricide) and the determination of cell death in the ventriculus and HPGs are presented. The pros and cons of the methodology are also discussed.

Immunohistochemical methods are useful in honeybee research to detect and assess the level of apoptosis and necrosis in the midgut and hypopharyngeal glands of adult bees.

ミツバチ組織における組織学の基礎と細胞死検出

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...