נתמכים על ידי JDRF, ה-NIH (R01-DK081469), העמים של פנסילבניה (המרכז למצוינות הרגנרציה לרפואה מענק 4100043362), מצעד הפרוטות (בזיל אוקונור האשכול פרס מחקר מלומד), וכן אוניברסיטת פנסילבניה טייס DERC היתכנות מענק (DK19525).

1. רקמות סימון CldU ו IdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אנלוגים thymidine (CldU או IdU) במים. לשקול מ&quot;ל 1mg / כימי כל ולהוסיף להפריד בקבוקי זכוכית של מים מזוקקים. אנחנו בדרך כלל להכין 1 ליטר של כל אחד בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את כימיקלים בצלחת ומערבבים או צורה אחרת של מסית. CldU תתמוסס בתוך 10 דקות. של תסיסה בטמפרטורת החדר. IdU דורש יותר משעה של תסיסה על 37 מעלות צלזיוס שייקר. מקורות המים יכולים להשפיע על מסיסות IdU. אם IdU נשאר השעייתה אחרי לילה רועד, נסה מקור שואב מים. הפתרונות מאוחסנים 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול הפתרון thymidine first המכיל (או CldU או IdU) כדי העכברים לתקופה תיוג הרצוי. אל תאפשר עכברים יש גישה למים ללא תווית בתקופת התווית. כאשר תקופת תיוג ייעודיים הושלמה, להתחיל סחף במים ללא תווית עבור 24 שעות לפחות (אנלוגים המכיל thymidine יש נסיוב וחצי חייהם של כמה שעות). ניהול הפתרון thymidine נוספת שהכילה (או CldU או IdU) כדי העכברים לתקופה תיוג הרצוי. מילוי בקבוקי מים באופן קבוע על מנת למנוע התייבשות! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, עכברים יכולים להיות מתויג בזריקה intraperitoneal רציפים של CdlU ואז IdU. הכן CldU או IdU בריכוז 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. IdU עשויים לדרוש ירידה מבחינת תוספת של פתרון נתרן הידרוקסיד מרוכז ואחריו רועד נמרץ להיכנס ההשעיה. אל תוסיף סודיום הידרוקסיד עודף. הוסף טיפה אחת של סודיום הידרוקסיד לפתרון 10 מ&quot;ל של IdU ואחריו שעה של תסיסה על 37 מעלות צלזיוס שייקר. אם לא נמצא פתרון, חזור על תוספת של סודיום הידרוקסיד. הזרק 100mcg לכל גרם משקל הגוף לחלל intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות בקרה חיוניים פרוטוקול זה. כתוצאה מכך, אנו ממליצים החוקרים לבצע כמה וריאציות של תיוג אנלוגי thymidine כדי להבטיח רגישות וספציפיות. אלה צריכים לכלול 1. עכברים תויגו רק עם CldU 2. עכברים תויגו רק עם IdU; 3. עכברים תויגו ברצף עם CldU ואז IdU; 4. עכברים תויגו ברצף בסדר הפוך, קודם עם IdU ואז CldU; 5 עכברים כי הם מדומה שכותרתו עם מים בלבד. כאשר לומדים תווית עם CldU ו IdU, החוקרים תמיד צריך לבצע את הפרוטוקול כולו עם כל 5 סטים של שקופיות מעל לשלוט מרקמות של עניין. </li></ol> 2. קציר רקמות, קיבעון, ו Slide הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הרדמה המתאים, לבצע מנת יתר קטלנית ואז להקריב העכבר באמצעות exsanguination. הסרה של רקמה טרי לתקן עם paraformalehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העברת רקמות למאגר 01:04 חנות בפורמלין ב 4 ° C להטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחילופין, לבצע מנת יתר קטלנית אנקב את העכבר דרך החדר הלב נשאר עם תמיסת מלח עד דם מנוקה מן הגוף, ואז מיד perfuse עם 30-50 סמ&quot;ק של paraformaldehyde 4%. הסר את הרקמות של עניין חנות מאגר 01:04 פורמלין על 4 מעלות צלזיוס להטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התייבשות רקמה והטבעה פרפין, לחתוך 5 מיקרון סעיפים רקמות מקום על גבי שקופיות טעונה. אופים את השקופיות על 65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות על מנת להבטיח הידבקות של רקמות להחליק (חיוני עם צעדים אנטיגן אחזור בהמשך). </li></ol> 3. , התייבשות Permeabilization ו Antigen Retrieval <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פרפין עודף ידי טבילה שקופיות שתי אמבטיות קסילן במשך 5 דקות. כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם הרקמה ידי טבילה שקופיות אתנול מדולל במים: 100, 95, 90, 80 70 ו 50%. משרים את השקופיות עבור 3 דקות. בריכוז אחד, החל 100% ו הולכת לקראת 50% לטבילה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עבור 5 דקות. ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים ידי טבילה שקופיות פתרון Triton-X 0.2% במשך 5 דקות (עשה טריים בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות לאחזור רקמות מיקרוגל אנטיגן. מניחים את השקופיות לתוך כוס זכוכית עם נפח מספיק 0.01M pH 6.0 סודיום ציטרט חיץ, כך שהפתרון מכסה 5 ס&quot;מ מעל החלק העליון של השקופיות לתת דין וחשבון על אובדן אויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל שקופיות עד הפתרון הוא רותחים (30-10 דקות. במלוא העוצמה). צמצום כוח עד לפתרון רותח לאט (10-80%) ולהמשיך 20 דקות נוספות. בדוק מיקרוגל מעת לעת כדי להבטיח את הפתרון נשאר לרתיחה איטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוס המקום המכיל שקופיות על גבי ספסל, ולאפשר בעדינות כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, (כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקופיות הם בטמפרטורת החדר באמצעות מדחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות לטבול 1.5N HCL 40 דקות. בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים 1X PBS, 5 דקות. לכל לשטוף. </li></ol> 4. יסודי ותיכון נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב השקופיות להישאר לחה מאוד באמצעות פרוטוקול כולו. רקמה יבש יהיה אוטומטי הרבה יותרפלואורסצנציה, מה שהופך שהתקבל תמונות שמיש. כדי למנוע גוסס, שקופית אחת התהליך בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל סעיף מעגל בשקופיות עם נוזל חוסם (כלומר, שעווה) עט. מניחים את השקופיות לתוך מיכל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא הדגירה לח על ידי הנחת מגבות נייר רטוב מונח שטוח על החלק התחתון של מיכל פלסטיק אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא פתרון חסימת בסרום חמור 10% בדילול מלא 1x PBS. חשוב לכסות כל חלק לחלוטין עם הפתרון. עבור חלקים כי הם רקמה 1 x 1.5 ס&quot;מ, נפח של 50 מיקרו ליטר פתרון לכל סעיף מספיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הפתרון חוסם את השקופיות. הסר שקופיות 1x PBS ולחסל נוזל עודף בעדינות על ידי הקשה על קצה להחליק על ערימה של מגבות נייר יבש. מקום להחליק בתא דגירה ולהוסיף 50 מיקרו ליטר פתרון לחסום 10% כל מקטע. כאשר כל השקופיות הושלמו לסגור את מיכל דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול נוגדן ראשוני לאיתור IdU. מדולל עכבר אנטי BrdU בריכוז 1:250 ב חמור בדם 5% מתוצרת 1x PBS. הקש את פתרון לחסום משקופית ומקום בחזרה לתוך תא הדגירה. הוסף את הנוגדן הראשוני לעיל סעיף דגירה כל לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף חומרה גבוהה (אשר ממזער מחייב ידי antisera אנטי BrdU העכבר כדי CldU). מאפרים TBST טרי נמוך חיץ מלח (36mM טריס, NaCl 50mm, 0.5% tween-20; pH 8.0). אתה צריך 40 מ&quot;ל של חיץ לכל זוג של שקופיות. הוסף 40 מ&quot;ל של חיץ צינור חרוטי 50 מ&quot;ל כל אחד. לפני הוספת שקופיות, מחממים את הפתרון 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שניים בכל פעם, להסיר שקופיות מתא הדגירה, למקם אותם גב אל גב (כך דגימות רקמה פנים רחוק אחד מהשני) ואת הברז נוגדן ראשוני עודף. מניחים את השקופיות הצינורות מלאים TBST מלח לכסות נמוך. להתסיס את הצינורות עבור 20 דקות. ב רועדת התרבות חיידקים באינקובטור עם הטמפרטורה ב 37 ° C, ואת המהירות מוגדר 225 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות פעמיים ב טרי 1X PBS. 5 דקות. לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הבא נוגדן ראשוני לאיתור CldU ו אנטיגן רקמה, אם תרצה בכך. מדולל עכברוש אנטי BrdU בריכוז 1:250 ב חמור בדם 5% מתוצרת 1x PBS. מדולל antisera העיקרית נגד אנטיגן רקמה על עובד ריכוז לתוך הפתרון נוגדן ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש עודף 1x PBS את השקופיות, ולמקם אותם בתא דגירה. הוסף נוגדן ראשוני סעיף כל דגירה לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות פעמיים ב טרי 1X PBS. 5 דקות. לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון נוגדנים משני. מדולל Cy2 חמור נגד חולדה כדי 1:250 ו Cy5 חמור נגד העכבר כדי 1:500 בתמיסה המכילה סרום 1X PBS חמור 5%. הוסף Cy3 משני לזהות מינים העיקרי של antisera אנטיגן רקמה. כמו כן, לדלל פתרון 0.4mg / mL המניות של DAPI עד 1:150 בתמיסה הנוגדן משנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש עודף 1X שקופיות PBS את מקום בתא דגירה. הוסף פתרון נוגדנים משני כל מקטע ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות פעמיים ב טרי 1X PBS. 5 דקות. לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש עודף 1X PBS את השקופיות לדבוק זכוכית מכסים להאריך זהב אנטי לדעוך התקשורת הרכבה (אל תשתמש Vectashield עם צבעים dyanine!). לחצו על תלושי לכסות כדי למנוע בועות אוויר. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 5. דימות וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה רקמת עניין עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מקור אור אנרגיה גבוהה, תוכנית, apochromatic יעדים, יעילות גבוהה מיקרוסקופ המצלמה (למשל Hamamatsu אורקה ER). צלמו תמונות של AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (אנטיגן רקמות), ו Cy5 (IdU) ערוצים. מיזוג תמונות ליצור קובץ יחיד רב שכבתיים התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מבוצעת כראוי, גרעינים DAPI מוכתם יהיה בהיר הומוגנית. אנטיגן רקמות (למשל אינסולין), צריך לחשוף תאים של עניין. אם מכתים עם DAPI או רקמות אנטיגן חלש או לא עקבי, שקופיות לטבול 1X PBS לילה להסיר את כיסוי לחמוק ולחזור על יישום antisera משנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על אנטיגן רקמה Cy3. בדוק CldU והכתים IdU ב Cy2 ו Cy5 ערוצים, החלפת בין ערוצים. חפש תגובתיות צולבת הפוטנציאל בין סמנים, כפי שצוין על ידי IdU מופרזת CldU שיתוף חיוביות. חפש רקמות שמכילות רק CldU או IdU. חוסר גרעינים או CldU IdU חיובי עשוי להצביע על בעיה טכנית עם תיוג או מכתים. במקרה זה, לחפש טישו replicative מאוד (למשל קשרי לימפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונות. הצגת שכבות המכילות DAPI ו אנטיגן רקמה. באמצעות סמן לוח לבן ביד הדומיננטית ודלפק תא ביד הלא דומיננטית, סמן כל גרעין עם סימן מנוגדים בטוש למחוק יבש (aka סמן לוח לבן). ספירת תאים DAPI חיובי בתוך הרקמה של עניין. שיא לספור תא מוחלט. השתמש במחק להסיר את סימני יובש. הצגת השכבהs המכיל DAPI, אנטיגן רקמות, CldU. ספירת תאים CldU חיובי בתוך הרקמה של עניין. שיא CldU לספור התא אך לא למחוק את הסימנים. שינוי התצוגה לדמיין שכבות המכיל אנטיגן רקמה, CldU ו IdU. הרוזן CldU IdU תאים חיובי כפול. ערך שיא, למחוק את כל הסימונים, ולהציג שכבות המכילות DAPI, אנטיגן רקמות, IdU. ספור את המספר הכולל של תאים IdU חיובי בתוך הרקמה של עניין. שיא IdU לספור התא. </li></ol> 6. נציג תוצאות אנחנו ברצף שכותרתו 6 בן שבוע נקבות עכברים עם CldU למשך שבוע ולאחר מכן IdU במשך שבועיים, בעקבות הקרבה המיידית. Pancreata היו מוכתמים לזהות CldU, IdU, ו אינסולין (אנטיגן רקמה), כמו גם DAPI. איי היו מוכתמים אחיד עם אינסולין. גרעינים CldU היו מוכתמים נבדל גרעינים IdU צבעונית (איור 2). גרעינים רבים מחוץ איון היו CldU IdU שיתוף חיוביים (איור 2, ימין למטה, חצים לבנים). תא בודד אינסולין חיובי היה מכתים גרעיני הן CldU ו IdU (איור 2, ימין למטה, חץ מגנטה). עכברים. ניסויים עם עכברים כל בוצעו על פי הנחיות ועדת IACUC של בית החולים לילדים של פילדלפיה. נקבה B6.129 F1 wild-type עכברים נרכשו מ Taconic (Germantown ניו יורק), שוכנו במתקן חיה במעבדה בבית החולים לילדים של פילדלפיה, והאכילה עכבר דיאט 5015 מ PMI תזונה הבינלאומי (Richmond. אינדיאנה). תיוג אסטרטגיה. על ידי סימון התא הראשון חלוקת האירוע CldU (מסומן ירוק בתכנית זו) ואת חלוקת התא השני עם IdU (מסומן באדום בתכנית זו), רציפים חלוקת התא תוצאות שיתוף שכותרתו תאים עם שני CldU ו IdU (ירוק / אדום) . תוצאות נציג תיוג thymidine של מחזור התא בתוך הלבלב בעכברים. תמונה Immunofluorescent של הלבלב עכבר עם איון לנגרהנס במרכז. עכבר היה רווי CldU שבוע 1 ואז IdU 2 שבועות במי השתייה לפני להקריב מיידית. מדגם לבלב היה מעובד כמתואר בפרוטוקול. תמונות אובייקטיבי 40X, עם שכבות נפרדות מוצגת מתאים לספור. תמונות שמוזגו מכילים DAPI (לבן) CldU (ירוק), IdU (אדום), אינסולין (צהוב). (העליון משמאל) DAPI ואינסולין. (העליונה, מימין) CldU ואינסולין. (נמוך, משמאל) IdU ואינסולין. (נמוך, מימין) CldU, IdU, ו אינסולין. בר סולם: 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. אסטרטגיה תיוג. על ידי סימון התא הראשון חלוקת האירוע CldU (מסומן ירוק בתכנית זו) ואת חלוקת התא השני עם IdU (מסומן באדום בתכנית זו), רציפים חלוקת התא תוצאות שיתוף שכותרתו תאים עם שני CldU ו IdU (ירוק / אדום) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות נציג תיוג thymidine של מחזור התא בתוך הלבלב בעכברים. תמונה Immunofluorescent של הלבלב עכבר עם איון לנגרהנס במרכז. עכבר היה רווי CldU שבוע 1 ואז IdU 2 שבועות במי השתייה לפני להקריב מיידית. מדגם לבלב היה מעובד כמתואר בפרוטוקול. תמונות אובייקטיבי 40X, עם שכבות נפרדות מוצגת מתאים לספור. תמונות שמוזגו מכילים DAPI (לבן) CldU (ירוק), IdU (אדום), אינסולין (צהוב). (העליון משמאל) DAPI ואינסולין. (העליונה, מימין) CldU ואינסולין. (נמוך, משמאל) IdU ואינסולין. (נמוך, מימין) CldU, IdU, ו אינסולין. בר סולם: 100μm.

<ol>
	<li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+regeneration+of+adult+Beta+cells+does+not+involve+specialized+progenitors.">Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors.</a> Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).</li><li>Kiel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+do+not+asymmetrically+segregate+chromosomes+or+retain+BrdU.">Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU.</a> Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).</li><li>Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin1/ErbB4+signaling+induces+cardiomyocyte+proliferation+and+repair+of+heart+injury.">Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury.</a> Cell. 138, 257-257 (2009).</li><li>Rankin, M. M., Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Beta+Cell+Proliferation+Is+Severely+Restricted+with+Advanced+Age.">Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age.</a> Diabetes. , (2009).</li><li>He, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+Protein+Stability+Is+Regulated+in+Pancreatic+Beta+Cells.">Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells.</a> Mol Endocrinol. , (2009).</li><li>Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+growth:+an+unusual+paradigm+of+organogenesis+that+is+cyclin+D2/Cdk4+dependent.">Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent.</a> Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).</li><li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+slow+turnover+of+beta-cells+in+aged+adult+mice.">Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice.</a> Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).</li><li>Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dexamethasone+and+5-bromodeoxyuridine+on+protein+synthesis+and+secretion+during+in+vitro+pancreatic+development.">Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development.</a> Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).</li><li>Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-bromodeoxyuridine+may+alter+the+differentiative+program+of+the+embryonic+pancreas.">5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas.</a> J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).</li><li>Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+5-bromodeoxyuridine+inhibition+of+exocrine+pancreas+differentiation.">On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation.</a> J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).</li><li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+pancreatic+islet+cell+proliferation+by+heavy+water+labeling.">Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+and+bioorthogonal+reactions:+unprecedented+selectivity+in+the+labeling+of+biological+molecules.">Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules.</a> Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).</li><li>Buck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).</li><li>Huising, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRFR1+is+expressed+on+pancreatic+beta+cells,+promotes+beta+cell+proliferation,+and+potentiates+insulin+secretion+in+a+glucose-dependent+manner.">CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).</li><li>Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).</li><li>Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ordered+architecture+of+murine+ear+epidermis+is+maintained+by+progenitor+cells+with+random+fate.">The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate.</a> Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).</li></ol>

ניסויים עם עכברים כל בוצעו במתקן חיה בבית החולים לילדים של פילדלפיה על פי ההנחיות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).

הגישה שלנו להתקרב thymidine מבוסס תיוג מחזור התא יש יישומים פוטנציאליים רבים במחקר ביו. עד כה, אנחנו מתרכזים בלבלב, אבל יש לנו גם ליישם אסטרטגיה זו לבחון תחלופת התאים של העור, המעי, הכבד, הכליות הכליה, אשך, שחלות, בלוטת התריס, בלוטת לימפה, hematopoiesis, המוח 1. בגלל תחלופת התאים נע בין רקמה לרקמה, אסטרטגיות תיוג צריך להיות מותאם אישית כדי להשיג את המידע משכנעת ביותר מאיבר של עניין. מוריסון ועמיתיו השתמשו CldU ו IdU ליום 1 לכל תווית hematopoiesis 2. קון ועמיתיו להשתמש CldU ו IdU במשך 4 ימים כל לזהות חלוקת התא התחדשות שריר הלב 3. לעומת זאת, השתמשנו CldU ו IdU עד 9 חודשים סך תווית מחזור התאים הבזליים בתוך איים הלבלב, רקמה עם מחזור התא מינימלי כפי הגילאים חיה 1,4-6. יישום הפוטנציאל הברור ביותר של האסטרטגיה שלנו היא תיוג ללימודי להגדיר את תחלופת התאים בתוך רקמת הומאוסטזיס. אבל הטכניקה שלנו יש מספר יישומים פוטנציאליים אחרים. למשל, יש לנו גם להחיל לאחרונה בטכניקה זו כדי לזהות שינוי בשעור בתוך רקמות, שם מהמוקדים של שכפול מוגברת ניתן לזהות בקלות על ידי שילוב מוגבר של CldU או IdU 5. מוריסון ועמיתיו השתמשו CldU ו IdU ליום 1 כל לבדיקת התנהגות תווית שמירה של בתאי גזע hematopoietic 2. יש לנו גם להחיל thymidine רציפים אנלוגי תיוג כדי לקבוע אם המעבר, הגברה תאים לתרום לצמיחה או התחדשות של רקמות 1. בשנת הממשל יישום רציף של אנלוגים thymidine מייצג גישה חדשנית לחקר מקורותיו ואת ההישרדות של תאים מעורבים הומאוסטזיס רקמות. אנלוגים Thymidine לא אמור לשמש ללא זהירות. אנלוגים סינתטיים thymidine יש פוטנציאל רעילות לתאי חלוקה, והשימוש בהן יכול תיאורטית לפגוע תחלופת התאים בבעלי חיים גוברת. אנלוגים Thymidine שימשו סוכני radiosensitizing למען ילדים חולי סרטן, ועלול להאט מחזור התא. לפיכך אנו קוראים לחוקרים לחקור בזהירות על פוטנציאל רעילות ברקמות העניין שלהם. לדוגמה, Trumpp ועמיתיו לגלות כי BrdU מערכתית יכול להכריח בתאי גזע hematopoietic להיכנס מחזור התא 7. למשל, ראטר ועמיתיו גילו כי מינון גבוה thymidine אנלוגים רעילים בפיתוח לבלב 8. לאחרונה Hellerstein ועמיתיו KineMed, Inc מצאו כי BrdU הממשל מאט תוך איון שגשוג על ידי 16-25% באמצעות תיוג קניינית כבד מים טכניקה 9. ההכנות איון שלם בשימוש על ידי Hellerstein ועמיתיו הכלול האנדוקרינית רבים אחרים סוגי תאים אנדוקריני שאינם, אשר יכול לכלול עד 50% ההכנות איון מוחלט. עם זאת, אנו מוצאים כי אינפוזיה ממושכת של BrdU אינו משפיע על בטא התפשטות תאים בעכברים בוגרים צעירים, כפי שהיא נמדדת על ידי ביטוי ki67 4. כמו כן, בטווח הארוך הממשל של CldU ו IdU לא נראה לפגום תא בטא המוני הרחבה 1. יתר על כן, בטא ריבוי שיעורי סלולריים הם המקבילה בין עכברים שכותרתו עם BrdU עבור תקופות זמן ארוכות ועכברים מסומנים רק לכמה שעות (שיעורי מנורמל לתקופות זמן שווה ערך). יחד, משתמע מתוצאות אלה כי עכברים יכולים לסבול בבטחה לטווח ארוך במינון נמוך הממשל של אנלוגים thymidine. ובכל זאת, אנחנו לא יכולים לשלול את פוטנציאל הרעילות של אנלוגים thymidine בצמיחה בטא בלבלב התא. כתוצאה מכך, אנו ממשיכים לבצע בקרות כאשר תיוג עכברים עם אנלוגים thymidine, והדחף חוקרים אחרים לעשות זאת גם כן. הטכניקה שלנו של תיוג thymidine רציפים אנלוגי הוא לא בלי pitfalls ואתגרים טכניים. כתוצאה מכך, שקופיות בקרה חשובים במיוחד. יש לנו שנוצר שקופיות בקרה מורכב של רקמות שונות 1) עכברים תויגו רק עם CldU:.. 2) עכברים תויגו רק עם IdU;. 3) עכברים תויגו ברצף עם CldU ואז IdU;. 4) עכברים תויגו ברצף בסדר הפוך, קודם עם IdU ואז CldU;. 5) עכברים כי הם מדומה שכותרתו עם מים בלבד. כאשר לומדים תווית עם CldU ו IdU, החוקרים תמיד צריך לבצע את הפרוטוקול כולו עם כל 5 סטים של שקופיות מעל מרקמות של עניין. תגובתיות בין קלה בין CldU ו IdU הוא החיסרון מצער אך בלתי נמנעים תיוג עם שני אנלוגים thymidine. הטכניקה CldU ו IdU מבוסס על ההבדלים זיקות בין antisera כי הופקו במקור מינים שונים (עכבר וחולדה) נגד BrdU. פרוטוקול שלנו, בעוד מסורבלת, נועד למזער את תגובתיות לחצות כזה. כתוצאה מכך, אנו ממליצים על זהירות בקרב חוקרים הרואים דילוג שלב (ים) של פרוטוקול. בפרט, יש לנונתקלו בבעיות עם antisera משנית כי הם תגובתי לעבור בין עכבר וחולדה. זה יכול להיות ממוזער על ידי שימוש antisera ג&#39;קסון כי הם מלא צולבות adsorbed בין עכבר וחולדה. מדי פעם אנו מצליחים לזהות כראוי ההתאגדות thymidine. במקרים כאלה הוא קריטי חשוב להשתמש בשקופיות בקרה חיובית כדי לקבוע איזה מגיב או צעד לא עבד. קשיים בדרך כלל עקב aliquots רע של antisera, מגלשות יבשות, או permeabilization גרעיני לקוי. נכשלנו בהצלחה תווית בפיתוח עוברים עם IdU. לפיכך, לא כל רקמות עשויה להיות חדיר IdU. חלופות CldU ו IdU תיוג thymidine כפול אנלוגי הם באופק. EDU (5-ethinyl deoxyuridine-2) יכול להיות המצע של catalyzed זיהוי נחושת כימיה לחץ 10,11. שיטות זיהוי Edu אינם דורשים הפרדת גדילי דנ&quot;א, ולפיכך הם נוחים מאוד לניתוח על ידי 12 cytometry הזרימה. Edu תואם, אך לא לחצות תגובתי עם BrdU 10. Edu שימש לכמת תחלופת התאים של רקמות שונות, כולל עכבר לתאי בטא בלבלב 13, בתאי המעי L 14 ו - 15 אפידרמיס. Edu יקר למדי כרגע ($ 1000 בארה&quot;ב לכל 500 מ&quot;ג). עם זאת, זיהוי Edu נראה הרבה יותר רגישים מאשר BrdU זיהוי 10. לכן, זה יכול להיות מבחינה כלכלית לשלב Edu ו BrdU במקום CldU ו IdU. שיטה זו עשויה גם לאפשר זיהוי של שלושה סיבובים שונים של חלוקת התא בעכברים שכותרתו פי שלוש עבור edu, CldU ו IdU. לסיכום, הטכניקה שלנו תיוג thymidine רציפים אנלוגי היא גישה חדשנית לגילוי מחזור התא. אנו מקווים הגישה שלנו מאפשרת למדענים אחרים כדי לכמת בצורה מדויקת יותר חלוקת התא, ואנו מצפים שזה יהיה פתוח פרדיגמות חדשות הומאוסטזיס רקמות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

מדידה מדויקת של חלוקת התא היא אתגר בסיסי בביולוגיה ניסויית זה הופך מורכב יותר ויותר לאט כאשר התאים המתחלקים מנותחים. שיטות הוקמה כדי לזהות חלוקת התא כוללים להדמיה ישירה על ידי מיקרוסקופית מתמדת תרבית תאים, דילול של צבעים חיוניים כגון carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl אסתר (CFSE), חיסונית זיהוי של אנטיגנים mitogenic כגון ki67 או PCNA ו אנלוגים thymidine. אנלוגים Thymidine ניתן להבחין באמצעות מגוון שיטות לרבות זיהוי רדיו עבור thymidine tritiated, חיסונית לגילוי bromo-deoxyuridine (BrdU), כלורו-deoxyuridine (CldU) ו-iodo deoxyuridine (IdU), וזיהוי כימיים ethinyl-deoxyuridine (EDU). יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine שונים (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת לחוקרים לכמת במדויק שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. לפי פרוטוקולים immunostaining אופטימיזציה הגישה שלנו יכולה לזהות נמוך מאוד thymidine מנה אנלוגים מנוהל באמצעות מי השתייה, בטוח לנהל לעכברים לתקופות ממושכות של זמן. כתוצאה מכך, הטכניקה שלנו יכולה לשמש כדי לזהות תחלופת התאים ברקמות מאוד האריכה ימים. אופטימלית תוצאות מכתים immunofluoresent ניתן להשיג סוגי רקמות מרובות, כולל הלבלב, העור, המעי, הכבד, הכליות, אשך, שחלות, בלוטת התריס, בלוטת לימפה, מוח. יש לנו גם ליישם את הטכניקה הזו כדי לזהות שינוי בשעור בתוך רקמות. יש לנו יותר ליישם את הטכניקה הזאת כדי לקבוע אם המעבר, הגברה תאים לתרום לצמיחה או התחדשות של רקמות. במובן זה, הממשל רציפים של אנלוגים thymidine מייצג גישה חדשנית לחקר מקורותיו ואת ההישרדות של תאים מעורבים הומאוסטזיס רקמות.

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue at JoVE.com

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.

איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.5K Views.  University of Pennsylvania-School of Medicine. יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.

Video: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.