Apoiado pelo JDRF, o NIH (R01-DK081469), Estado da Pensilvânia (Centro de Excelência em Medicina Regenerativa conceder 4100043362), a March of Dimes (Basil O&#39;Connor Iniciado Prêmio de Pesquisa Scholar), e da Universidade de Pennsylvania piloto DERC e viabilidade de subvenção (DK19525).

1. Tecidos rotulagem com CldU e UDI <ol><li> Dissolver análogos da timidina (CldU ou UDI) na água. Pesar mL 1mg / de cada produto químico e adicionar para separar garrafas de vidro de água destilada. Normalmente, prepare um litro de cada vez. </li><li> Dissolver os produtos químicos em uma placa de agitação ou outra forma de agitador. CldU vai dissolver em 10 min. de agitação à temperatura ambiente. UDI requer mais de uma hora de agitação a 37 ° C em um agitador. Fontes de água podem influenciar a solubilidade UDI. Se UDI permanece reativada após a agitação durante a noite, tente uma fonte mais limpa de água. As soluções são armazenadas a 4 ° C no escuro. </li><li> Administrar a solução contendo timidina primeiro (ou CldU ou UDI) para os ratos para o período de rotulagem desejado. Não permita que ratos para ter acesso à água sem rótulo durante o período de etiqueta. Quando o período de rotulagem designado é concluída, iniciar um washout com água sem rótulo, pelo menos, 24 horas (os análogos da timidina contendo soro têm meias-vidas de várias horas). Administrar a solução contendo timidina segundo (ou CldU ou UDI) para os ratos para o período de rotulagem desejado. Garrafas de água de recarga regularmente para evitar a desidratação! </li><li> Alternativamente, os camundongos podem ser rotulados por injeção intraperitoneal seqüencial de CdlU e UDI. Prepare CldU UDI ou de 10 mg / mL de concentração. UDI podem exigir gota a gota, adição de solução concentrada de hidróxido de sódio seguido de agitação vigorosa para entrar em suspensão. Não adicionar hidróxido de sódio em excesso. Adicionar uma gota de hidróxido de sódio a uma solução de 10 mL de UDI seguido por uma hora de agitação a 37 ° C em um agitador. Se não na solução, repita adição de hidróxido de sódio. Injetar 100mcg por g de peso corporal no espaço intraperitoneal. </li><li> As lâminas de controlo são essenciais para este protocolo. Como resultado, nós sugerimos investigadores realizar diversas variações de timidina rotulagem analógica para garantir a sensibilidade e especificidade. Estes devem incluir 1. Ratos que foram apenas marcados com CldU, 2. Ratos que foram rotulados apenas com parceiros UDI; 3. Ratos que foram seqüencialmente marcados com CldU e UDI, em seguida, 4. Ratos que foram rotulados sequencialmente na ordem inversa, primeiro com UDI e, em seguida, CldU, 5 ratos que são rotulados simulada apenas com água. Quando aprender a etiqueta com CldU e UDI, os investigadores devem sempre realizar todo o protocolo com todos os 5 jogos acima de lâminas de controlo a partir do tecido de interesse. </li></ol> 2. Preparação de colheita de tecidos, Fixação, e Slide <ol><li> Usando anestésico apropriado, realizar overdose letal e, em seguida, o sacrifício do mouse através de sangria. Remover o tecido fresco e fixar com paraformalehyde 4% a 4 ° C por 24 horas. Transferência de tecido para 1:04 tampão formalina e armazenar a 4 ° C para a incorporação. </li><li> Alternativamente, execute overdose letal e, em seguida, perfundir o mouse através do ventrículo cardíaco esquerdo com solução salina até que o sangue é eliminado do organismo, em seguida, imediatamente perfundir com 30-50 cc de paraformaldeído 4%. Remover os tecidos de interesse e armazenar em 1:04 tampão formalina a 4 ° C para a incorporação. </li><li> Após a desidratação dos tecidos e inclusão em parafina, corte seções 5 micra de tecido e coloque em lâminas carregadas. Asse as lâminas a 65 ° C por 16 horas para assegurar a adesão de tecido a deslizar (essencial com passos antígeno de recuperação abaixo). </li></ol> 3. Recuperação de desidratação, permeabilização, Antigen e <ol><li> Retire o excesso de parafina pela imersão slides em dois banhos de xileno por 5 min. cada um. </li><li> Reidratar o tecido por imersão slides em etanol diluído com água: 100, 95, 90, 80 70 e 50%. Embeber os slides durante 3 min. para cada concentração, começando com 100% e indo para 50% para a imersão final. </li><li> Lavagem das lâminas durante 5 min. em 1x PBS. </li><li> Permeabilizar as células por imersão slides em 0,2% solução de Triton X-por 5 min (feito fresco de cada vez). </li><li> Prepare slides para microondas recuperação antigênica do tecido. Colocar as lâminas em um copo de vidro com um número suficiente de 0,01 M pH 6,0 volume de citrato de sódio, de modo que a solução abrange cinco centímetros acima da parte superior dos slides para explicar a perda por evaporação. </li><li> Microondas slides até que a solução está fervendo (3-10 min. Potência máxima). Reduzir o poder até que a solução está lentamente a ebulição (10-80%) e continue por um adicional de 20 min. Verifique microondas periodicamente para garantir a solução mantém-se em uma fervura lenta. </li><li> Copo contendo slides lugar em uma bancada e deixe esfriar ligeiramente à temperatura ambiente, (aproximadamente 2 horas). </li><li> Confirmar que os slides estão em temperatura ambiente usando um termômetro. </li><li> Imergir as lâminas em 1.5N HCL por 40 min. à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes em 1X PBS, 5 min. por lavagem. </li></ol> 4. Anticorpos primários e secundários <ol><li> É importante que os slides continuam muito úmido através de todo o protocolo. Tecido seco terá muito mais autoFluorescência, tornando as imagens resultantes inutilizável. Para evitar morrer, deslize um processo de cada vez. </li><li> Seção de cada círculo nos slides com um líquido de bloqueio (ie, cera) caneta. Coloque os slides de volta para o recipiente de 1x PBS. </li><li> Faça uma câmara de incubação úmida, colocando toalhas de papel molhado deitadas no fundo de um recipiente plástico hermeticamente fechado. </li><li> Compõem solução de bloqueio de soro burro de 10% diluído em PBS 1x. É importante cobrir inteiramente cada seção com a solução. Para secções de tecido que são 1 x 1,5 centímetros, um volume de 50 micro-litros de solução por seção é suficiente. </li><li> Adicionar a solução de bloqueio para os slides. Remover slides de 1x PBS e eliminar o excesso de líquido batendo na borda de slides em uma pilha de toalhas de papel seco. Slides lugar na câmara de incubação e adicionar 50 micro-litros de solução de bloco de 10% para cada seção. Quando todos os slides estão concluídas fechar o recipiente e deixe em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Prepare diluição do anticorpo primário para detectar UDI. Diluir rato anti-BrdU na concentração 1:250 em 5% burro soro feito em 1x PBS. Torneira solução bloco de slide e coloque de volta para a câmara de incubação. Adicione o anticorpo primário acima de cada seção e incubar overnight a 4 ° C. </li><li> Prepare lavar rigor elevado (o que minimiza ligação com o mouse anti-soros anti-BrdU para CldU). Compõem tampão TBST fresco baixo sal (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% tween-20, pH 8,0). Você vai precisar de 40 mL de tampão por par de slides. Adicionar 40 mL de tampão a cada tubo cônico de 50 mL. Antes de adicionar slides, pré-aquecer a solução a 37 ° C. </li><li> Dois ao mesmo tempo, remover slides da câmara de incubação, coloque-os back-to-back (de modo que amostras de tecido rosto um do outro) e torneira anticorpo primário em excesso. Coloque as lâminas na tubos cheios de TBST baixo teor de sal e tampe. Agitar os tubos por 20 min. em um tremendo cultura bacteriana incubadora com a temperatura a 37 ° C, ea velocidade ajustada para 225 rpm. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes em fresco 1X PBS. 5 min. por lavagem. </li><li> Prepare a solução de anticorpos próxima primária para detecção de antígeno CldU e tecido, se desejar. Diluir rato anti-BrdU na concentração 1:250 em 5% burro soro feito em 1x PBS. Diluir anti-soros primários contra o antígeno do tecido em trabalhar a concentração na solução de anticorpo primário. </li><li> Toque excesso de PBS 1x fora dos slides, e colocá-los na câmara de incubação. Adicionar anticorpo primário para cada seção e incubar overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes em fresco 1X PBS. 5 min. por lavagem. </li><li> Preparar a solução de anticorpo secundário. Diluir Cy2 burro anti-rato de 1:250 e Cy5 burro anti-rato a 1:500 em PBS 1X uma solução contendo soro burro de 5%. Adicionar Cy3 secundário para detectar as espécies primárias do anti-soro antígeno de tecido. Além disso, diluir uma solução estoque 0,4 mg / mL de DAPI a 1:150 em solução de anticorpo secundário. </li><li> Toque excesso de 1X PBS desliza e coloque na câmara de incubação. Adicionar solução de anticorpo secundário para cada seção e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes em fresco 1X PBS. 5 min. por lavagem. </li><li> Toque excesso de 1X PBS fora dos slides e aderir tampa de vidro com Prolong Ouro anti-fade meios de montagem (NÃO use Vectashield com corantes dyanine!). Imprensa sobre lamínulas para eliminar bolhas de ar. Armazenar a 4 ° C. </li></ol> 5. Análise de imagem e <ol><li> Imagem do tecido de interesse com um microscópio de fluorescência equipado com uma fonte de alta energia da luz, plano-apocromático objetivos, e uma câmera de microscópio de alta eficiência (por exemplo, Hamamatsu Orca ER). Capturar imagens no AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antígeno do tecido), e Cy5 (UDI) canais. Mesclar imagens para criar um único arquivo de imagem multi-camada. </li><li> Se realizado corretamente, DAPI núcleos corados será homogeneamente brilhante. Antígeno do tecido (insulina por exemplo) deve revelar células de interesse. Se a coloração com DAPI ou tecido antígeno é fraca ou inconsistente slide, mergulhe em 1X PBS durante a noite para remover tampa de deslizamento e repita a aplicação do anti-soro secundário. </li><li> Concentre-se no antígeno em tecido Cy3. Verifique CldU e UDI coloração em Cy2 e Cy5 canais, alternando entre os canais. Olhar para o potencial de reatividade cruzada entre os marcadores, como indicado pela UDI excessiva e CldU co-positividade. Procure tecidos que contêm apenas CldU ou UDI. Falta de CldU ou UDI núcleos positivos podem indicar um problema técnico com a rotulagem ou marcação. Neste caso, procure um tecido altamente replicativo (por exemplo, linfonodos). </li><li> Analisar imagens. Mostrar camadas contendo DAPI e antígeno do tecido. Usando um marcador de quadro branco na mão dominante e um contador de células na mão não-dominante, marca cada núcleo com um ponto de contraste com um marcador seca apagar (aka branco marcador board). Contagem de células DAPI positivas no tecido de interesse. Registro da contagem de células total. Use uma borracha seca para remover marcas. Camada de apresentaçãos contendo DAPI, antígeno do tecido, e CldU. Contagem de células CldU positivo no tecido de interesse. Registro da contagem de células CldU mas não apagar as marcas. Mudar o display para visualizar as camadas contendo antígenos do tecido, CldU, e UDI. Contar CldU UDI dupla células positivas. Valor recorde, apagar todas as marcas, e exibir camadas contendo DAPI, antígeno do tecido, e UDI. Contar o número total de células UDI positivos dentro do tecido de interesse. Registro da contagem de células UDI. </li></ol> 6. Resultados representante Nós rotulados sequencialmente 6 semanas de idade camundongos fêmeas com CldU por uma semana e depois UDI por duas semanas, seguido pelo sacrifício imediato. Pancreata foram coradas para detectar CldU, UDI, e insulina (um antígeno do tecido), bem como DAPI. Ilhotas foram uniformemente corados com insulina. CldU núcleos corados eram distintos UDI núcleos corados (Figura 2). Muitos núcleos fora do ilhéu foram CldU UDI co-positivos (Figura 2, abaixo à direita, setas brancas). Uma célula de insulina único positivos tinham coloração nuclear para ambos CldU e UDI (Figura 2, parte inferior direita, seta magenta). Camundongos. Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê IACUC do Hospital Infantil da Filadélfia. Feminino B6.129 F1 do tipo selvagem ratos foram adquiridos da Taconic (Germantown New York), alojados nas instalações com animais de laboratório do Hospital Infantil da Filadélfia, e alimentados com a dieta do rato de 5015 PMI Nutrition International (Richmond. Indiana). Rotulagem estratégia. Ao classificar o evento de primeira divisão celular com CldU (marcado verde nesse esquema) e da divisão celular em segundo lugar com UDI (marcado a vermelho neste esquema), os resultados de células seqüenciais divisão em co-rotulados com as duas células CldU e UDI (verde / vermelho) . Resultados representativos da rotulagem timidina do volume de negócios no pâncreas de células dentro de camundongos. Imunofluorescência imagem de um pâncreas de rato com ilhotas de Langerhans no centro. Mouse foi infundido com CldU por 1 semana e depois UDI por 2 semanas na água de beber antes de sacrifício imediato. Amostra de pâncreas foi processado como descrito no protocolo. 40x imagens objetivas, com camadas distintas exibido adequado para contagem. Imagens fundidas contêm DAPI (branco) CldU (verde), UDI (vermelho), insulina (amarelo). (Superior, à esquerda) DAPI e insulina. (Superior, direita) CldU e insulina. (Inferior, à esquerda) UDI e insulina. (Inferior, à direita) CldU, UDI, e insulina. Barra de escala: 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Estratégia de Etiquetagem. Ao classificar o evento de primeira divisão celular com CldU (marcado verde nesse esquema) e da divisão celular em segundo lugar com UDI (marcado a vermelho neste esquema), os resultados de células seqüenciais divisão em co-rotulados com as duas células CldU e UDI (verde / vermelho) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultados Representante da rotulagem timidina do volume de negócios no pâncreas de células dentro de camundongos. Imunofluorescência imagem de um pâncreas de rato com ilhotas de Langerhans no centro. Mouse foi infundido com CldU por 1 semana e depois UDI por 2 semanas na água de beber antes de sacrifício imediato. Amostra de pâncreas foi processado como descrito no protocolo. 40x imagens objetivas, com camadas distintas exibido adequado para contagem. Imagens fundidas contêm DAPI (branco) CldU (verde), UDI (vermelho), insulina (amarelo). (Superior, à esquerda) DAPI e insulina. (Superior, direita) CldU e insulina. (Inferior, à esquerda) UDI e insulina. (Inferior, à direita) CldU, UDI, e insulina. Barra de escala: 100μm.

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Todos os experimentos com camundongos foram realizados nas instalações de animais no Hospital Infantil da Filadélfia, de acordo com as diretrizes do Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

Nossa abordagem para timidina abordagem baseada em volume de negócios à rotulagem célula tem muitas aplicações potenciais na pesquisa biomédica. Até à data, têm-se concentrado sobre o pâncreas, mas também temos aplicado esta estratégia para examinar a renovação celular da pele, intestino, fígado, rim, adrenal, testículos, ovários, tireóide, linfonodos, hematopoiese e cérebro 1. Porque renovação celular varia de tecido para tecido, as estratégias de rotulagem deve ser personalizado para obter as informações mais interessantes do órgão de interesse. Morrison e seus colegas usaram CldU e UDI para 1 a cada dia para rotular hematopoiese 2. Kuhn e seus colegas usam CldU e UDI, durante 4 dias cada um para detectar a divisão celular na regeneração do miocárdio 3. Em contraste, temos usado CldU e UDI por até 9 meses total a etiqueta volume de negócios de células basais dentro de ilhotas pancreáticas, um tecido com volume de negócios célula mínima que o animal envelhece 1,4-6. A aplicação mais óbvia potencial da nossa estratégia de rotulagem é de estudos para definir a renovação celular dentro da homeostase do tecido. Mas a nossa técnica tem várias outras aplicações potenciais. Por exemplo, nós também recentemente aplicou esta técnica para identificar a transformação oncogênica dentro dos tecidos, onde áreas focais de aumento da replicação pode ser facilmente identificado pela incorporação crescente de UDI CldU ou 5. Morrison e seus colegas usaram CldU e UDI para 1 a cada dia para testar o comportamento de fixação da etiqueta de células-tronco hematopoéticas 2. Temos também aplicada rotulagem analógica sequencial timidina para determinar se o trânsito ampliando células contribuem para o crescimento ou renovação dos tecidos 1. Nesta administração de aplicações seqüenciais de análogos de timidina representa uma nova abordagem para estudar as origens ea sobrevivência das células envolvidas na homeostase do tecido. Análogos da timidina não deve ser utilizado sem precaução. Análogos da timidina sintéticos têm toxicidade potencial de células em divisão, e seu uso pode, teoricamente, prejudicar a renovação das células em animais em crescimento. Análogos da timidina têm sido usados ​​como agentes radiosuscetível para pacientes com câncer, e pode retardar a renovação celular. Assim, apelamos a investigadores para investigar com cautela para toxicidades potenciais em seus tecidos de interesse. Por exemplo, Trumpp e seus colegas acham que BrdU sistêmica pode forçar células-tronco hematopoéticas para entrar ciclo celular 7. Por exemplo, Rutter e colegas observaram que os análogos da timidina altas doses são tóxicos para o desenvolvimento de pâncreas 8. Mais recentemente Hellerstein e seus colegas na KineMed, Inc descobriu que retarda BrdU administração intra-ilhota proliferação de 16-25% usando uma técnica de rotulagem de propriedade de água pesada 9. Os preparativos da ilhota utilizada por toda Hellerstein e colegas contidas endócrinas e muitos outros tipos de células endócrinas não, o qual pode incluir até 50% das preparações das ilhotas total. No entanto, descobrimos que a infusão prolongada de BrdU não influencia a proliferação de células beta em camundongos adultos jovens, medido pelo Ki67 expressão 4. Da mesma forma, a longo prazo administração de CldU e UDI não parece prejudicar a expansão da massa de células beta 1. Além disso, as taxas de proliferação de células beta são equivalentes entre camundongos rotulados com BrdU por longos períodos de tempo e de ratos que só são rotulados por algumas horas (taxas são normalizados para períodos de tempo equivalente). Juntos, esses resultados sugerem que os ratos podem tolerar com segurança a longo prazo da administração de baixa dose de análogos da timidina. Ainda assim, não podemos descartar potencial de toxicidade por análogos da timidina na pâncreas crescimento das células beta. Como resultado, continuamos a realizar os controlos quando rotulagem camundongos com análogos da timidina, e exortar outros investigadores a fazê-lo também. Nossa técnica de marcação seqüencial análogos da timidina não isenta de riscos e desafios técnicos. Como resultado, lâminas de controlo são especialmente importantes. Temos gerado slides de controle que consistem em vários tecidos a partir de 1) Os ratos que foram apenas marcados com CldU;.. 2) Os ratos que foram rotulados apenas com parceiros UDI;. 3) Os ratos que foram seqüencialmente marcados com CldU e UDI;. 4) ratos que foram rotulados sequencialmente na ordem inversa, primeiro com UDI e, em seguida, CldU;. 5) Os ratos que são rotulados simulada apenas com água. Quando aprender a etiqueta com CldU e UDI, os investigadores devem sempre realizar todo o protocolo com todos os 5 jogos acima de slides a partir do tecido de interesse. Reatividade cruzada entre ligeira CldU e UDI é uma desvantagem infeliz, mas inevitável para rotulagem com ambos os análogos da timidina. A técnica CldU e UDI é baseada nas diferenças de afinidades entre anti-soros que foram originalmente derivados contra BrdU em diferentes espécies (rato e rato). Nosso protocolo, enquanto pesado, é projetado para minimizar tais reatividade cruzada. Conseqüentemente, nós pedimos cautela entre os pesquisadores que consideram pular etapa (s) do protocolo. Em particular, temosencontrou problemas com anti-soros secundárias que são reativos cruzada entre ratos e ratinhos. Isto pode ser minimizado pelo uso de anti-soros Jackson que são totalmente cross-adsorvidas entre ratos e ratinhos. Ocasionalmente, não conseguem detectar adequadamente a incorporação de timidina. Em tais casos, é extremamente importante o uso de lâminas de controlo positivo para determinar qual reagente ou passo não estava funcionando. Dificuldades são tipicamente devido à má alíquotas de soros, slides seco, ou permeabilização nuclear inadequada. Falhamos com sucesso rótulo desenvolver embriões com UDI. Assim, nem todos os tecidos podem ser permeável ao UDI. Alternativas para CldU e UDI para a dupla marcação análogo da timidina estão no horizonte. Edu (5-etinil-2 deoxiuridina) pode ser um substrato para a detecção de cobre química catalisada clique 10,11. Métodos de detecção Edu não requerem a separação das fitas de DNA, e são, portanto, altamente passível de análise por citometria de fluxo 12. Edu é compatível, mas não reativa cruzada com BrdU 10. Edu tem sido utilizada para quantificar a renovação celular dos tecidos do mouse diversos, incluindo células pancreáticas beta 13, células L intestinais 14 e epiderme 15. Edu é bastante caro no momento (mil dólares dos EUA por 500mg). Ainda assim, a detecção de Edu parece ser muito mais sensível que a detecção BrdU 10. Assim, pode ser economicamente viável para combinar Edu e BrdU em vez de CldU e UDI. Este método também pode permitir a detecção de três diferentes rodadas de divisão celular em camundongos triplamente rotulado para Edu, CldU, e UDI. Em resumo, a nossa técnica de marcação seqüencial análogos da timidina é uma nova abordagem para detecção de renovação celular. Esperamos que a nossa abordagem permite que outros cientistas para quantificar com mais precisão a divisão celular, e esperar que ele vai abrir novos paradigmas na homeostase do tecido.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

Medição precisa da divisão celular é um desafio fundamental em biologia experimental, que se torna cada vez mais complexo quando lentamente células em divisão são analisados. Métodos estabelecidos para detectar a divisão celular incluem a visualização direta por microscopia contínua em cultura de células, a diluição de corantes vitais como carboxifluoresceína di-aetate succinimidyl éster (CFSE), imuno-detecção de antígenos mitogênicos como a Ki67 ou PCNA, e os análogos da timidina. Análogos da timidina pode ser detectado por uma variedade de métodos incluindo rádio-detecção de timidina tritiada, imuno-detecção de bromo-deoxiuridina (BrdU), cloro-deoxiuridina (CldU) e iodo-deoxiuridina (UDI), e detecção química de etinil-deoxiuridina (Edu). Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de diferentes análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de ratos adultos. Nosso método permite que os investigadores quantificar com precisão duas rodadas sucessivas de divisão celular. Por meio da otimização de protocolos imunocoloração nossa abordagem pode detectar análogos dose muito baixa timidina administrada através da água potável, segura para administrar a ratinhos durante períodos prolongados de tempo. Conseqüentemente, a nossa técnica pode ser usada para detectar renovação celular nos tecidos muito longa. Obter óptimos resultados de coloração immunofluoresent pode ser conseguido em vários tipos de tecido, incluindo pâncreas, pele, intestino, fígado, adrenal, testículos, ovários, tireóide, linfonodos e cérebro. Temos também aplicou esta técnica para identificar a transformação oncogênica dentro dos tecidos. Temos ainda mais aplicada essa técnica para determinar se o trânsito ampliando células contribuem para o crescimento ou renovação dos tecidos. Neste sentido, a administração seqüencial de análogos da timidina representa uma nova abordagem para estudar as origens ea sobrevivência das células envolvidas na homeostase do tecido.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de camundongos adultos para quantificar duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta estratégia é útil para detectar renovação celular de longa duração tecidos, transformação oncogênicos, ou de trânsito ampliando-células.

Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.5K visualizações.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de camundongos adultos para quantificar duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta estratégia é útil para detectar renovação celular de longa duração tecidos, transformação oncogênicos, ou de trânsito ampliando-células.

Vídeo: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biologia

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.