وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست من خلال منح لAPM [076566/Z/05/Z] ، JCK [074318] وجائزة الأساسية للمركز ويلكوم ترست لعلم الوراثة البشرية [075491/Z/04].

1) خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أنواع الخلايا التعبير عن الجينات في المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خطوط الخلايا متخالف كلا الخيارين لمخاطر الحمض النووي وكتب تعدد الأشكال الترميز داخل الجين من الفائدة (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خطوط الخلية المحددة وفقا لمواصفات المورد وإعداد 2 × 10 سم أطباق بتري لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وعلى التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الخلايا يصل إلى 80 ٪ التقاء بدء إجراءات لعزل الخلايا المحاصيل والدنا والرنا إما باتباع الإجراء المبين أدناه ، أو باستخدام أدوات متوفرة تجاريا. </li></ol> 2) استخراج الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من الطبق ، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة إلى ميكرولتر 500 طبق من حل تحلل (0.6 ٪ SDS ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي تريس ، 20 ملي EDTA وميكروغرام / 50 مل ريبونوكلياز A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صخرة لوحة بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط lysate الخلية في أنبوب microcentrifuge واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بروتين K إلى التركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي مع حجم مساو من الفينول كلوروفورم - 8 أس هيدروجيني ، وتكرار ، ثم استخراج مع حجم مساو من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب الحمض النووي مع 1 / كلوريد الصوديوم حجم ال 10 م 3 و 2.5 أحجام من الإيثانول بنسبة 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يترك على الجليد لمدة 5 دقائق ثم تدور دورة في الدقيقة 13000 لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الحمض النووي مع الايثانول 70 ٪ ، والسماح ليجف في الهواء وresuspend في 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم يترك لمدة 2 يوما في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحل في 4 درجات مئوية على المدى الطويل أو على -20 درجة مئوية. </li></ol> 3) استخراج الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من الطبق ، ويغسل مع برنامج تلفزيوني ، إضافة 1 مل من TRIzol واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا كشط ، ماصة بضع مرات ، ونقل في أنبوب microcentrifuge واحتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 10 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف في أنبوب جديدة وإضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة وتدور لمدة 10 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة مائي في أنبوب جديد وإضافة حجم مساو من الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الحل إلى 1 أو 2 (حسب الحجم) العمود RNeasy وتدور لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هنا اتبع تعليمات من عدة RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) إعداد نموذج الأحماض النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحمض النووي الريبي وتركيز استخدام الطيف NanoDrop (الحرارية العلمية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد [كدنا] from 500-1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام decamers العشوائية ومرتفع الثالث عكس الناسخ (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> 5) PCR والفحص التمهيدي ملحق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم اثنين من أزواج من الاشعال PCR لكل علامة الحمض النووي ، وزوج واحد لتضخيم الحمض النووي الجيني والزوج الآخر لتضخيم [كدنا] (الشكل 2). مكان إلى الأمام وعكس التمهيدي لتضخيم [كدنا] exons متماثلة في مختلف لتجنب التلوث الجيني. التصميم التمهيدي للحصول على منتج PCR في نطاق طول غليان 100-500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ميكرولتر تفاعل PCR بما في ذلك 0.5 طق Immolase U (Bioline) dNTPs ملي 0.8 ، 2 مم MgCl 2 ، 0.2 م كل التمهيدي و 20 نانوغرام إما [كدنا] أو الحمض النووي. تضخيم كل عينة في أربعة ردود الفعل المستقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل تفاعل PCR في ظل الظروف الأمثل لكل زوج التمهيدي حفظ عدد دورة في المرحلة الخطية من التضخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PCR التمهيدي وdNTPs الزائد عن طريق احتضان المنتج PCR مع نوكلياز خارجية الأول والفوسفاتاز القلوية الروبيان (SAP) في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقعة كل منتج PCR مرتين على طبق من 384 جيدا ، بحيث 8 القياسات سوف تكون متاحة لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصميم التمهيدي التمديد مع برنامج الفحص (Sequenom) تصميم بحيث يمكن استخدام نفس التمهيدي لمنتجات كلا PCR الجينومية و[كدنا]. تحديد طول التمهيدي في نطاق 14-18 سنة مضت بما في ذلك التمديد ومزيج من تركيبات 3ddNTPs (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ ردود الفعل والتحليل التمهيدي تمديد MALDI-TOF/MS باستخدام نظام MassARRAY (Sequenom) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملحق التمهيدي نموذجية تشمل رد فعل خطوة ابتداء من 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 40 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 5 ليالي و 52 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 72 درجة مئوية لمدة 5 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنظيف المنتجات تمديد التمهيدي مع الراتنج SpectroCLEAN ونقل على ميكروأري (رقاقة) من خلال موزع nanolitre SpectroPOINT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكميا [أليغنوكليوتيد] مدد - TOF MALDI باستخدام مطياف الكتلة SpectroREADER. </li></ol> 6) التحليل الإحصائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من نتائج MALDI-TOF/MS مع برنامج من نوع MassARRAY للجودة عام من التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج تقرير Allelotyping الذي يتضمن بيانات منطقة الذروة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل فرد حساب الطيفالنسبة بين منطقة ذروة أليل 1 و أليل 2 (الذروة نسبة المساحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة [كدنا] اشتقاق نسبة منطقة الذروة تعني والانحراف المعياري ، وذلك باستخدام وظيفة المناظرة في Excel ، عبر قياسات 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اشتقاق نفس المنطقة يعني نسبة الذروة عبر قياسات 8 لالحمض النووي الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [كدنا] تقسيم نسبة يعني نسبة متوسط ​​الجينومية لتقييم هذا الانحراف إلى نسبة 1:1 من المتوقع. </li></ol> 7) التجريبية التحكم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبعاد الأعمال الفنية التجريبية ، وتكرار تجربة ما لا يقل عن ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما كان ذلك ممكنا المقايسات التصميم والحمض النووي للعلامات إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم عدة أزواج التمهيدي PCR والاشعال تمديد الصلب إلى فروع كل من الأمام والعكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما كان ذلك ممكنا اختبار كما سلبية خطوط الخلايا التي يتم التحكم عن علامات الحمض النووي متغايرة ولكنها لا تحمل مخاطر المتغيرات المرتبطة الحمض النووي النمط الظاهري (الشكل 1 والشكل 3) </li></ol> 8) الممثل النتائج ويرد مثال على أليل محددة تحليل التعبير في الشكل (3) مع أمثلة من آثار مطياف الكتلة. هذا الرقم يدل على النتائج من خلال تحليل 4 أليل محددة من المنتجات تمديد التمهيدي نفذت في 4 قوالب مختلفة. الرسوم البيانية للأعلى تمثل النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل الحمض النووي الجيني اثنين من خطوط الخلايا المختلفة ، والتي هي على حد سواء متخالف لتعدد الأشكال كتب الترميز. ومع ذلك ، خط خلية فقط A هو متخالف لمخاطر البديل DNA (الشكل 1). انخفاض الرسوم البيانية تمثل النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل [كدنا] المتولدة من خطوط الخلية نفسها. نتيجة لقطعة أثرية التجريبية ذروة الأولى هي دائما أعلى من الذروة الثانية حتى في التحليل الجيني. لذلك ، يتم استخدام النتائج من خلال التحليل الجيني لتطبيع البيانات [كدنا]. بعد التطبيع ، نسبة أليل يختلف كثيرا عن 1 في خط الخلية A (حيث الذروة الثانية يبدو أقل بالمقارنة مع الأطياف الأخرى) ، في حين أنه قريب جدا من خط 1 في الخلية باء وتشير البيانات إلى أن خط الخلية ويحمل الحمض النووي المتغير ، في المرحلة مع أليل تقاس الذروة الثانية ، مما يقلل من التعبير عن الجينات قيد التحليل. الخلية B خط يوفر سيطرة مريحة للغاية السلبية. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. خطوط خلية خلية استراتيجية اختيار خط ألف وباء ومتخالف للعلامة كتب الترميز (المثلث) ، ولكن خط الخلية فقط هي البديل عن متخالف الحمض النووي للخطر (دائرة). يرتبط أليل الزرقاء من مخاطر البديل (إما مع وجود تأثير مباشر أو لأن في الارتباط الوثيق مع المتغير الوظيفية الفعلية) مع انخفاض مستوى النسخ. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. أليل محددة تمديد مقايسة التمهيدي ، وهذا الرقم يظهر تدفق العمل لتنفيذ الإجراء التجريبي لكل من الحمض النووي [كدنا] (يسار) والجينوم (يمين) القوالب. صممت PCR الاشعال (المستطيلات الرمادية) لتضخيم تعدد الأشكال متخالف الترميز (المثلث). لتجنب التلوث الجيني PCR الاشعال يصلب متواليات وضعت في exons متماثلة مختلفة (الحانات ضوء أزرق) عندما يتم تضخيم خارجا على قالب [كدنا]. ثم يتم استخدام المنتج PCR كقالب لتتعرف رد فعل تمديد نفذت التمهيدي مع التمديد ، الصلب على قاعدة بجانب تعدد الأشكال ، والمزيج المناسب من ثلاثة dideoxynucleotide (ddNTPs) الإنهاء (المربعات) وواحدة deoxynucleotide (دائرة) ليمتد التمهيدي من أساس واحد أو اثنين على التوالي. تمديد التمهيدي الناتجة المنتجات والجماهير المختلفة التي تسمح للفصل وتقدير من قبل مطياف الكتلة - TOF MALDI. كمية المنتج المطابق للأليل الزرقاء من الحمض النووي هو علامة أقل نسبيا لأليل الحمراء. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. نتائج الأليل محددة مقايسة التعبير. الشكل تظهر نتائج مطياف الكتلة من التحليل الذي أجري على الحمض النووي الجيني و[كدنا] من خط الخلية A و B خط الخلية (الشكل 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذه الطريقة تمكن من تقييم تأثير الأمراض المرتبطة المتغيرات الحمض النووي على التعبير الجيني عن طريق تقييم الفرق في الجسم الحي محددة أليل في مستوى النص. في هذا البروتوكول هو قياس وفرة نسبية من خلال نص TOF MALDI ، ولكن غيرها من التكنولوجيات السماح الكمي أليل محددة ، مثل TaqMan 6،7 ، يمكن استخدام. القيد الرئيسي لهذا النهج هو توافر كتب علامات الترميز. ووصف الأساليب على أساس مبدأ هنا ، ولكن الاستفادة من فئات مختلفة من الأشكال المتعددة ، وقد وصفت. في مقايسة haploChip تدابير محددة أليل التعبير باستخدام علامات يقع في حدود 1 كيلو بايت من بداية النسخي أو موقع نهاية الجين الذي سيكون حاضرا في لونين immunoprecipitated المواد المعزولة مع الأجسام المضادة المحددة لرنا بوليميريز الثاني 8. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام intronic النيوكلوتايد عندما القالب heteronuclear RNA 9. وصف بروتوكول معين هنا ، في تركيبة مع مقايسة haploChip ، وقد استخدم بنجاح لتحديد الجينات مرشح لعسر القراءة (القراءة أو العجز). في البداية حددت دراسة جمعية الوراثية DNA تسلسل المرتبطة عسر القراءة والذي يمتد ثلاثة جينات 10. اظهر أليل محددة التعبير الجيني في الفحص ان وجود عسر القراءة المرتبطة اختلاف الحمض النووي التعبير عن المتغيرات لوحظ واحد فقط من الجينات الثلاثة ولكن ليس ال 11 الأخرى اثنين.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

عدد كبير من الجمعيات وراثية معقدة مع الصفات المشتركة في تزايد مستمر. ومع ذلك ، لم تكن معظم هذه الجمعيات المفهوم على المستوى الجزيئي. واحدة من آليات الوساطة تأثير المتغيرات الحمض النووي على الظواهر هو التعبير الجيني ، وهو ما ثبت أن تكون ذات أهمية خاصة لصفات معقدة 1. هذا الأسلوب في الاختبارات السياق الخلوية تأثير تسلسل الحمض النووي محددة على التعبير الجيني. المبدأ هو لقياس الوفرة النسبية للمحاضر الناشئة عن الأليلات اثنين من الجينات ، وتحليل الخلايا التي تحمل نسخة واحدة من تسلسل الحمض النووي المرتبطة المرض (المتغيرات المخاطر) 2،3. لذا ، ينبغي أن الخلايا المستخدمة لهذا الأسلوب الوراثي تلبية شرطين أساسيين : يجب عليهم أن يكونوا متخالف سواء بالنسبة للمتغيرات المخاطر الحمض النووي DNA وعلامات ، الأشكال المتعددة الترميز عادة ، والتي يمكن تمييز النصوص على أساس أصلهم الكروموسومات (الشكل 1). المتغيرات مخاطر الحمض النووي DNA وعلامات لا حاجة الى تكرار الأليل نفسه ولكن في المرحلة (haplotypic) العلاقة بين علامات وراثية يجب أن يكون مفهوما. من المهم أيضا أن تختار أنواع الخلايا التي تعبر عن هذا الجين من الفائدة. هذا البروتوكول يشير تحديدا إلى الإجراء المعتمد لاستخراج الخلايا الليفية من الأحماض النووية ولكن هذه الطريقة تنطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا الأولية. يتم استخراج DNA و RNA من خطوط الخلية المحددة ، ويتم إنشاؤها [كدنا]. ويتم تحليل الحمض النووي و[كدنا] مع التمهيدي مقايسة الإرشاد ، ومصممة لاستهداف علامات الحمض النووي الترميز 4. ويتم التمديد لفحص التمهيدي خارج باستخدام (Sequenom) MassARRAY 5 منصة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. ثم يتم تحليل المنتجات تمديد التمهيدي بواسطة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOF/MS). لأن علامات المختارة هي متخالف فإنها تولد بين قمتين على ملامح MS. وتبلغ مساحة كل ذروة يتناسب مع وفرة نص ويمكن قياس مع وظيفة من برنامج من نوع MassARRAY لتوليد نسبة أليلية (أليل 1 : أليل 2) الحساب. هو تطبيع أليلية نسبة حصلت عليها لاستخدام [كدنا] أن يقاس من الحمض النووي الجيني ، حيث من المتوقع أن نسبة أليلية أن تكون لتصحيح 01:01 التحف الفنية. علامات مع نسبة لا تختلف كثيرا أليلية تطبيع إلى 1 تشير إلى أن كمية نص المتولدة من الكروموسومات اثنين في نفس الخلية مختلفة ، مما يدل على أن الحمض النووي المتغيرات المرتبطة النمط الظاهري يكون لها تأثير على التعبير الجيني. وينبغي أن تستخدم ضوابط التجريبية لتأكيد النتائج.

Watch this Scientific Journal Video about An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations at JoVE.com

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

الجمعيات الجينية غالبا ما تظل غير المبررة على مستوى وظيفي. هذا الأسلوب يهدف إلى تقييم تأثير النمط الظاهري المرتبطة علامات وراثية على التعبير الجيني عن طريق تحليل الخلايا متخالف لالنيوكلوتايد كتب. وتتيح تقنية قياس دقيقة بواسطة مطياف الكتلة - TOF MALDI لتحديد أليل محددة تمديد التمهيدي المنتجات.

الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

an-allele-specific-gene-expression-assay-to-test-functional-basis

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  University of Oxford. الجمعيات الجينية غالبا ما تظل غير المبررة على مستوى وظيفي. هذا الأسلوب يهدف إلى تقييم تأثير النمط الظاهري المرتبطة علامات وراثية على التعبير الجيني عن طريق تحليل الخلايا متخالف لالنيوكلوتايد كتب. وتتيح تقنية قياس دقيقة بواسطة مطياف الكتلة - TOF MALDI لتحديد أليل مح...

Video: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

الضوء / الظلام لاختبار الانتقال الفئران

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...