Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust attraverso sovvenzioni a APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] e un premio di base per il Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].

1) Colture Cellulari <ol><li> Selezionare i tipi di cellule che esprimono il gene di interesse. </li><li> Selezionare linee cellulari eterozigoti sia per le varianti di rischio e trascritto polimorfismo del DNA codifica all&#39;interno del gene di interesse (Figura 1). </li><li> Cultura le linee cellulari selezionate in base alle specifiche del fornitore e preparare 2 x 10 cm capsule di Petri per l&#39;estrazione del DNA e RNA, rispettivamente. </li><li> Quando le cellule raggiungono l&#39;80% confluenza avviare la procedura per le cellule raccolti ed isolare il DNA e l&#39;RNA sia seguendo la procedura descritta di seguito o con i kit disponibili in commercio. </li></ol> 2) Estrazione del DNA <ol><li> Rimuovere il supporto dal piatto, lavare con PBS e aggiungere al piatto 500 microlitri di una soluzione di lisi (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA e 50 mg / ml RNasi A). </li><li> Roccia delicatamente la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Raschiare il lisato di cellule in una provetta ed incubare a 37 ° C durante la notte. </li><li> Aggiungi proteinasi K alla concentrazione finale di 100 mg / ml ed incubare a 37 ° C durante la notte. </li><li> Estrarre il DNA con un uguale volume di fenolo-cloroformio pH 8, ripeto, quindi estrarre con un uguale volume di cloroformio / alcool isoamilico. </li><li> Precipitare il DNA con 1 / 10 ° volume 3 M di NaCl e 2,5 volumi di etanolo 100%. </li><li> Lasciare in ghiaccio per 5 minuti e poi girare a 13.000 giri per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare il DNA con etanolo al 70%, permette di asciugare all&#39;aria e risospendere in 200 ml di TE. </li><li> Incubare a 65 ° C per 10 min e poi lasciare per 2 giorni a temperatura ambiente. </li><li> Conservare a 4 ° C o lungo termine a -20 ° C. </li></ol> 3) estrazione RNA <ol><li> Rimuovere il supporto dal piatto, lavare con PBS, aggiungere 1 ml di TRIzol e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Raschiare le cellule, pipetta poche volte, trasferire in una provetta e incubare per 5 minuti. </li><li> Spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 200 ml di cloroformio. </li><li> Agitare e spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere un uguale volume di etanolo al 70%. </li><li> Caricare la soluzione a 1 o 2 (a seconda del volume) colonna RNeasy e spin per 30 secondi alla massima velocità. </li><li> Da qui seguire le istruzioni del kit RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) Nucleic Acid preparazione dei campioni <ol><li> Quantificare il DNA e la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li> Preparare cDNA da 500-1000 ng di RNA utilizzando decamers casuale e SuperScript III della trascrittasi inversa (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5) Estensione di analisi PCR e Primer <ol><li> Progettazione di due coppie di primers PCR per ogni marcatore del DNA, un paio per l&#39;amplificazione del DNA genomico e l&#39;altra coppia per l&#39;amplificazione del DNA (Fig. 2). Luogo in avanti e indietro primer per l&#39;amplificazione del DNA negli esoni diversi per evitare la contaminazione genomico. Progettazione primer per ottenere un prodotto di PCR nel range di 100-500 bp lunghezza. </li><li> Preparare una reazione da 10 microlitri di PCR compresi 0,5 U Immolase Taq (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M ogni primer e 20 ng di entrambi i cDNA o DNA. Amplificare ogni campione in quattro reazioni indipendenti. </li><li> Eseguire la reazione PCR nelle condizioni ottimizzate per ogni coppia di primer tenendo numero di ciclo in fase lineare di amplificazione. </li><li> Togliere di PCR e dNTPs in eccesso tramite l&#39;incubazione del prodotto di PCR con esonucleasi I e fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Spot ogni prodotto di PCR due volte su una piastra da 384 pozzetti, in modo che 8 misure saranno disponibili per ogni campione. </li><li> Progettare il fondo interno con il saggio Design (Sequenom) il software in modo che il fondo stesso può essere utilizzato per prodotti di PCR sia genomico e cDNA. Specificare la lunghezza fondo nel range di 14-18 bp e mescolare estensione anche combinazioni di 3ddNTPs (Fig. 2). </li><li> Effettuare la reazione di estensione primer e analisi MALDI-TOF/MS utilizzando il sistema MassARRAY (Sequenom) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Una tipica reazione di primer extension includono un passo a partire da 94 ° C per 2 minuti, seguita da 40 cicli di 94 ° C per 5 s, 52 ° C per 5 s e 72 ° C per 5 s. </li><li> I prodotti fondo estensione vengono puliti con resina SpectroCLEAN e trasferiti su microarray (chip) da dispenser SpectroPOINT nanolitre. </li><li> Gli oligonucleotidi estesi sono quantificati da MALDI-TOF SpectroREADER utilizzando uno spettrometro di massa. </li></ol> 6) Analisi Statistica <ol><li> Controllare i risultati MALDI-TOF/MS con il software Typer MassARRAY per la qualità generale di questo esperimento. </li><li> Estratto della relazione Allelotyping che include i dati dell&#39;area di picco. </li><li> Per ogni singolo spettro calcolare ilrapporto tra l&#39;area del picco di allele 1 e allele 2 (rapporto tra le aree di picco). </li><li> Per ogni campione di cDNA derivare un picco media il rapporto tra area e deviazione standard, utilizzando la funzione corrispondente in Excel, attraverso il 8 misure. </li><li> Ricavare la stessa media il rapporto tra area del picco in tutto l&#39;8 per tranne del DNA genomico. </li><li> Dividere il rapporto cDNA intendo per il rapporto genomica significa per valutare la deviazione per l&#39;atteso rapporto 1:1. </li></ol> 7) Controlli sperimentali <ol><li> Per escludere artefatti sperimentali, ripetere l&#39;esperimento, almeno tre volte. </li><li> Quando possibile, i test per i marcatori del DNA di design aggiuntivi. </li><li> Progettazione più coppie di primer PCR e primers estensione ricottura di fili sia in avanti che in retromarcia. </li><li> Ogni volta che prova possibile in quanto negativo linee cellulari controlli che sono eterozigoti per i marcatori del DNA, ma non portano le varianti del DNA rischio associato al fenotipo (fig. 1 e fig. 3) </li></ol> 8) Risultati Rappresentante Un esempio di allele-specifica analisi di espressione è mostrata in Figura 3 con esempi di tracce di spettrometria di massa. La figura mostra i risultati delle analisi di 4 prodotti fondo allele-specifica estensione effettuato su 4 diversi modelli. I grafici in alto rappresentano i risultati ottenuti dall&#39;analisi del DNA genomico di due diverse linee cellulari, che sono entrambi eterozigoti per un polimorfismo trascritto codifica. Tuttavia, solo una linea cellulare è eterozigote per la variante del DNA di rischio (Figura 1). I grafici inferiori rappresentano i risultati ottenuti dall&#39;analisi del cDNA generati dalle linee delle cellule stesse. Come risultato di artefatto sperimentale il primo picco è sempre superiore al secondo picco anche per l&#39;analisi genomica. Pertanto, i risultati dall&#39;analisi genomica sono utilizzati per normalizzare i dati cDNA. Dopo la normalizzazione, il rapporto allele è significativamente diverso da 1 nella linea cellulare A (dove il secondo picco appare più bassa rispetto alle altri spettri), mentre è molto vicino a 1 linea di cellule B. I dati suggeriscono che la linea cellulare A trasporta un variante del DNA, in fase con l&#39;allele misurata dal secondo picco, che riduce l&#39;espressione del gene in esame. Linea cellulare B offre un controllo molto comodo negativo. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Linea cellulare strategia di selezione. Linee cellulari A e B sono eterozigoti per un marker trascritto codifica (triangolo), ma solo una linea cellulare è eterozigote per la variante di rischio del DNA (cerchio). L&#39;allele azzurro della variante di rischio è associato (o con un effetto diretto o perché in stretta correlazione con la variante attuale funzionale) con un livello inferiore di trascrizione. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Allele-specifici test primer extension. Questa figura mostrano il work-flow della procedura sperimentale effettuato per entrambi i DNA cDNA (a sinistra) e genomica (a destra) i modelli. Primer PCR (rettangoli grigi) sono progettati per amplificare un polimorfismo eterozigote codifica (triangolo). Per evitare la contaminazione genomica primer PCR temprare sequenze collocati in differenti esoni (luce barre blu) quando l&#39;amplificazione è effettuata su modello di cDNA. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato come modello per una reazione di primer extension realizzato con un primer di estensione, ricottura una base vicino al polimorfismo, e il mix appropriato di tre dideoxynucleotide (ddNTPs) terminatori (quadrati) e uno desossinucleotidi (cerchio) per estendere l&#39;innesco di uno o due basi, rispettivamente. La risultante prodotti primer extension hanno masse diverse, che permettono la separazione e quantificazione mediante MALDI-TOF spettrometria di massa. La quantità di prodotto corrispondente alla allele azzurro del marcatore del DNA è relativamente più basso per l&#39;allele rosso. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. I risultati di un allele-specifici test di espressione. La figura mostrano i risultati di spettrometria di massa dall&#39;analisi effettuata sul DNA genomico e cDNA di linea cellulare delle cellule A e linea B (Figura 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo consente di valutare l&#39;effetto della malattia associata a varianti del DNA sull&#39;espressione genica attraverso la valutazione in vivo allele-specifica differenza nel livello di trascrizione. In questo protocollo abbondanza relativa trascrizione si misura con MALDI-TOF, ma altre tecnologie consentono la quantificazione allele-specifici, come TaqMan 6,7, può essere utilizzato. Il limite maggiore di questo approccio è la disponibilità di marcatori trascritto codifica. Metodi basati sul principio descritto qui, ma approfittando di diverse classi di polimorfismi, sono stati descritti. Il test haploChip misure allele-specifica espressione utilizzando marcatori situati entro 1 kb di inizio della trascrizione o sito fine di un gene che sarebbe presente in una materia cromatina immunoprecipitato isolato con anticorpi specifici per l&#39;RNA polimerasi II 8. In alternativa, SNPs intronico può essere utilizzato quando il modello viene eteronucleari RNA 9. Il protocollo specifico qui descritto, in combinazione con il test haploChip, è stato utilizzato con successo per identificare un gene candidato per la dislessia (o difficoltà di lettura). Inizialmente uno studio di associazione genetica identificata una sequenza di DNA associata a dislessia e che si estendono su tre geni 10. L&#39;allele-specifici test di espressione genica ha dimostrato che in presenza di dislessia, di DNA associati espressione varianti variazione è stata osservata solo per uno dei tre geni, ma non gli altri due 11.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

Il numero di importanti associazioni di genetica comune con tratti complessi è in costante aumento. Tuttavia, la maggior parte di queste associazioni non sono stati compresi a livello molecolare. Uno dei meccanismi che mediano l&#39;effetto di varianti del DNA sui fenotipi è l&#39;espressione genica, che ha dimostrato di essere particolarmente rilevante per i tratti complessi 1. Questo metodo verifica in un contesto cellulare l&#39;effetto di specifiche sequenze di DNA sull&#39;espressione genica. Il principio è quello di misurare l&#39;abbondanza relativa di trascrizioni derivanti dai due alleli di un gene, analizzando le cellule che portano una sola copia delle sequenze di DNA associate con la malattia (le varianti di rischio) 2,3. Pertanto, le cellule utilizzati per questo metodo dovrebbe rispondere a due requisiti fondamentali genotipica: devono essere eterozigote sia per le varianti del DNA e rischio di marcatori del DNA, polimorfismi di solito codifica, che possono distinguere trascrizioni base alla loro origine cromosomica (Figura 1). Varianti del DNA e rischio marcatori del DNA non c&#39;è bisogno di avere la stessa frequenza degli alleli, ma la fase (haplotypic) rapporto di marcatori genetici ha bisogno di essere compreso. E &#39;anche importante scegliere i tipi di cellule che esprimono il gene di interesse. Questo protocollo fa esplicito riferimento alla procedura adottata per l&#39;estrazione degli acidi nucleici da fibroblasti ma il metodo è ugualmente applicabile ad altri tipi di cellule, tra cui le cellule primarie. DNA e RNA sono estratti dalle linee cellulari selezionate e cDNA viene generato. DNA e cDNA vengono analizzati con un test primer extension, creato per identificare i marcatori del DNA codificante 4. Il test primer extension viene effettuata utilizzando la (Sequenom) MassARRAY 5 piattaforma secondo le specifiche del produttore. Prodotti primer extension vengono poi analizzati da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS). Perché gli indicatori selezionati sono eterozigoti che genererà due picchi sui profili MS. L&#39;area di ogni picco è proporzionale alla ricchezza trascrizione e può essere misurata con una funzione del software Typer MassARRAY per generare un rapporto allelica (allele 1: allele 2) calcolo. Il rapporto alleliche ottenute per cDNA è normalizzato con quello misurato dal DNA genomico, dove è atteso il rapporto allelica da 1:1 a correggere artefatti tecnici. Marcatori con un rapporto normalizzato alleliche significativamente diverso da 1 indicano che la quantità di trascrizione generato dai due cromosomi nella stessa cella è diversa, suggerendo che le varianti del DNA associate con il fenotipo hanno un effetto sull&#39;espressione genica. Controlli sperimentali dovrebbe essere usato per confermare i risultati.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Associazioni di genetica spesso rimangono inspiegabili a livello funzionale. Questo metodo si propone di valutare l&#39;effetto del fenotipo-marcatori genetici associati sull&#39;espressione genica analizzando cellule eterozigoti per SNP trascritte. La tecnologia permette la misura precisa di MALDI-TOF spettrometria di massa per quantificare allele-specifici prodotti primer extension.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

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22.7K Views.  University of Oxford. Associazioni di genetica spesso rimangono inspiegabili a livello funzionale. Questo metodo si propone di valutare l'effetto del fenotipo-marcatori genetici associati sull'espressione genica analizzando cellule eterozigoti per SNP trascritte. La tecnologia permette la misura precisa di MALDI-TOF spettrometria di massa per quantificare allele-specifici prodotti primer extension.

Video: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Luce / buio test di transizione per i Topi

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The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...