עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome באמצעות מענקים APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] וכן בפרס הליבה האמון Wellcome המרכז לגנטיקה של האדם [075491/Z/04].

1) תא התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת סוגי תאים המבטאים את הגן של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת שורות תאים הטרוזיגוטיים הן בסיכון גרסאות ה-DNA פולימורפיזם קידוד עיבד בתוך הגן של עניין (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות שורות תאים נבחרים על פי מפרט של הספק ולהכין 2 x 10 ס&quot;מ בצלחות פטרי להפקת DNA ו-RNA, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים 80% מפגש להתחיל את ההליך תאים יבולים ולבודד DNA ו-RNA או ביצוע ההליך המתואר להלן או באמצעות ערכות זמינים מסחרית. </li></ol> 2) מיצוי DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה המנה, לשטוף עם PBS ולהוסיף μL את צלחת 500 של פתרון תמוגה (0.6% SDS, 100 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס, 20 mM EDTA ו - 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​RNase A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסלע צלחת בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את lysate התא לתוך צינור microcentrifuge ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף proteinase K לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה-DNA עם נפח שווה של פנול, כלורופורם pH 8, חזור, ואז לחלץ עם נפח שווה של אלכוהול כלורופורם / isoamyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיץ את ה-DNA עם 1 / 10 נפח ה 3 M NaCl ו - 2.5 כרכים של 100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו על קרח דק 5 ואז לסובב בסל&quot;ד 13,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את ה-DNA עם אתנול 70%, כדי לאפשר אוויר יבש resuspend ב μL של TE 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן יוצאים 2 ימים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס או לטווח ארוך ב -20 ° C. </li></ol> 3) הפקת רנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה המנה, לשטוף עם PBS, מוסיפים 1 מ&quot;ל של TRIzol ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד, פיפטה כמה פעמים, להעביר בצינור microcentrifuge ו דגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקות 10 בסל&quot;ד 10,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant בצינור טריים להוסיף 200 μL של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתגעש ו ספין דקות 10 בסל&quot;ד 10,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית בתוך שפופרת טריים להוסיף נפח זהה של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען הפתרון 1 או 2 (בהתאם לכמות) טור ספין RNeasy ובמשך 30 שניות במהירות המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאן בעקבות הוראה של הערכה RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) חומצות גרעין לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת DNA ו-RNA ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת cDNA מ ng 500-1000 של רנ&quot;א באמצעות decamers אקראי עילי III הפוך transcriptase (Invitrogen) על פי הוראות היצרן. </li></ol> 5) ו-PCR הרחבה Assay פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב שני זוגות של primers PCR עבור כל סמן ה-DNA, זוג אחד עבור הגברה DNA גנומי לבין זוג אחרים הגברה cDNA (איור 2). מקום קדימה לאחור תחל עבור cDNA הגברה ב אקסונים שונים, כדי למנוע זיהום גנטי. עיצוב תחל לקבל מוצר PCR בטווח של 100-500 אורך נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 μL תגובת PCR כולל 0.5 U Immolase תקי (Bioline) dNTPs 0.8 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 0.2 מ &#39;כל אחד ו - 20 ng פריימר או של cDNA או דנ&quot;א. Amplify כל מדגם בארבעה תגובות עצמאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תגובת ה-PCR בתנאים אופטימיזציה עבור כל זוג פריימר שמירה מספר מחזור בשלב ליניארי של הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פריימר PCR ו dNTPs עודף ידי דוגרים המוצר PCR עם exonuclease ואני phosphatase שרימפס אלקליין (SAP) בשעה 37 ° C במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט כל מוצר PCR פעמיים על צלחת 384, טוב, כך 8 מדידות יהיה זמין עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב תחל הרחבה עם תוכנת עיצוב (Sequenom) Assay כך פריימר אותו יכול לשמש עבור מוצרים PCR הן cDNA גנומי. ציין אורך תחל בטווח של 14-18 נ&quot;ב ומערבבים הרחבה כולל שילובים של 3ddNTPs (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ההארכה פריימר התגובה וניתוח MALDI-TOF/MS באמצעות מערכת MassARRAY (Sequenom) בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה אופיינית הארכת תחל כוללים צעד החל מ 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 5 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הארכה המוצרים תחל מנקים עם שרף SpectroCLEAN והועברו על microarray (שבב) על ידי מנפק nanolitre SpectroPOINT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotides המורחבת הם לכמת ידי MALDI-TOF באמצעות ספקטרומטר מסה SpectroREADER. </li></ol> 6) ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תוצאות MALDI-TOF/MS עם התוכנה Typer MassARRAY לאיכות הכללית של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית הדו&quot;ח Allelotyping הכולל את הנתונים אזור השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל קשת הפרט לחשב אתהיחס בין שטח השיא של אלל אלל 1 ו 2 (יחס אזור השיא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה cDNA לגזור אזור השיא יחס ממוצע וסטיית התקן, באמצעות הפונקציה המתאימה ב-Excel, על פני 8 מדידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור את אותו אזור מתכוון יחס שיא ברחבי 8 measurments עבור ה-DNA הגנומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את יחס ממוצע cDNA על ידי היחס אומר גנטי כדי להעריך את הסטייה ליחס 01:01 צפוי. </li></ol> 7) ניסיוני Controls <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלול ממצאים ניסויים, לחזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, עיצוב מבחני עבור סמני דנ&quot;א נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב מספר זוגות PCR פריימר ואת primers הרחבה חישול אל חוטי שתי קדימה לאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל פעם מבחן האפשרי קווי שולטת שלילי סלולריים, כי הם הטרוזיגוטיים סמני ה-DNA, אך לא לשאת את הסיכון DNA וריאנטים הקשורים הפנוטיפ (איור 1, איור 3.) </li></ol> 8) נציג תוצאות דוגמה של ניתוח אלל מסוים הביטוי שמוצג באיור 3 עם דוגמאות של עקבות ספקטרומטריית מסה. האיור מציג את תוצאות ניתוח של 4-אלל מסוים תחל מוצרים הרחבה שבוצעו על 4 תבניות שונות. גרפים העליון מייצג את התוצאות שהתקבלו מניתוח של הדנ&quot;א הגנומי של שתי שורות תאים שונות, אשר שניהם הטרוזיגוטיים פולימורפיזם קידוד עיבד. עם זאת, רק קו תא הוא הטרוזיגוטיים עבור גרסה הסיכון DNA (איור 1). גרפים התחתון מייצג את התוצאות שהתקבלו מניתוח של cDNA שנוצר משימוש שורות תאים זהים. כתוצאה חפץ ניסיוני השיא הראשון הוא תמיד גבוה יותר מאשר השיא השני אפילו בניתוח הגנומי. לכן, התוצאות מניתוח גנומית משמשים לנרמל את הנתונים cDNA. לאחר נורמליזציה, יחס אלל שונה מהותית 1 בתור תא (כאשר השיא השני מופיע נמוך יותר לעומת הספקטרום אחרים), כאשר הוא קרוב מאוד 1 בתור תא B. הנתונים מראים כי קו התא נושא גרסה ה-DNA, בשלב עם אלל נמדד השיא השני, אשר מפחית את הביטוי של הגן תחת ניתוח. קו B Cell מספק שליטה נוחה מאוד שלילי. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. קו סלולרי אסטרטגיה הבחירה. שורות תאים A ו-B הם הטרוזיגוטיים סמן קידוד עיבד (משולש) אלא רק שורת תאים הוא הטרוזיגוטיים עבור גרסה הסיכון DNA (עיגול). האלל הכחול של וריאנט את הסיכון קשורה (או עם השפעה ישירה או משום מתאם הדוק עם גרסה התפקודית בפועל) עם רמה נמוכה של שעתוק. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. אלל ספציפי תחל הרחבה assay. נתון זה מראה את העבודה זרימה של הליך הניסוי שנערך עבור ה-DNA הן (מימין) תבניות cDNA (משמאל) הגנומי. PCR primers (מלבנים אפורים) נועדו להגביר פולימורפיזם קידוד הטרוזיגוטיים (משולש). כדי למנוע זיהום גנטי PCR primers לחשל רצפים להציב אקסונים שונים (אור ברים כחול) כאשר ההגברה נעשית על תבנית cDNA. המוצר PCR משמש אז לתגובת תחל הרחבה ביצע עם פריימר שלוחה כתבנית, חישול בסיס אחת ליד פולימורפיזם, ואת תערובת מתאימה של dideoxynucleotide שלושה (ddNTPs) לחסרי (ריבועים) ואחד deoxynucleotide (עיגול) להאריך את פריימר של בסיס אחד או שניים בהתאמה. הארכה המוצרים וכתוצאה מכך יש פריימר ההמונים שונים המאפשרים הפרדה וכימות ידי ספקטרומטריית MALDI-TOF המוני. כמות המוצר המתאים האלל הכחול של סמן ה-DNA הוא יחסית נמוך אלל אדום. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תוצאות assay-אלל מסוים הביטוי. הדמות להציג את התוצאות ספקטרומטריית מסה מניתוח שנערך על ה-DNA הגנומי ואת cDNA של שורת תאים קו תא B (איור 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטה זו מאפשרת הערכה של ההשפעה של מחלות הקשורות גרסאות ה-DNA על ביטוי גנים על ידי השומה ההבדל vivo אלל ספציפי ברמת התמליל. בפרוטוקול זה שפע תמליל יחסי נמדדת MALDI-TOF אבל טכנולוגיות אחרות המאפשר כימות אלל ספציפי, כגון TaqMan 6,7, ניתן להשתמש. המגבלה העיקרית של גישה זו היא הזמינות של סמנים קידוד עיבד. שיטות מבוססת על העיקרון המתואר כאן, אלא ניצול של סוגים שונים של פולימורפיזם, תוארו. Assay haploChip אמצעים אלל ספציפי ביטוי באמצעות סמנים ממוקם בתוך 1 קילו של תחילת תעתיק או אתר בסופו של הגן אשר יהיה נוכח חומר הכרומטין immunoprecipitated מבודד עם נוגדנים ספציפיים RNA פולימראז II 8. לחלופין, intronic SNPs ניתן להשתמש כאשר התבנית הוא heteronuclear RNA 9. פרוטוקול מסוים המתואר כאן, בשילוב עם assay haploChip, שימש בהצלחה לזהות גן מועמד דיסלקציה (או לקות קריאה). בתחילה מחקר גנטי העמותה זיהו רצף דנ&quot;א הקשורים דיסלקציה אשר פורש שלושה גנים 10. אלל ספציפי assay ביטוי גנים הראו כי בנוכחות של דיסלקציה הקשורים וריאציה גרסאות ה-DNA ביטוי נצפתה רק אחד משלושת הגנים, אך לא את שני 11.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

מספר עמותות גנטי משמעותי עם תכונות מורכבות נפוצה היא עולה בהתמדה. עם זאת, רוב עמותות אלה אינן מובנות ברמה המולקולרית. אחד המנגנונים המתווך את ההשפעה של גרסאות ה-DNA על פנוטיפים הוא ביטוי גנים, אשר הוכח להיות רלוונטי במיוחד עבור תכונות מורכבות 1. שיטה זו בדיקות בהקשר הסלולר את ההשפעה של רצפי DNA ספציפיים על ביטוי גנים. העיקרון הוא למדוד את השפע היחסי של תמלילי הנובעים שני אללים של הגן, ניתוח תאים הנושאים עותק אחד של רצפי DNA הקשורים במחלה (גרסאות סיכון) 2,3. לכן, תאים המשמשים בשיטה זו צריכים להיפגש genotypic שתי דרישות בסיסיות: הם צריכים להיות הטרוזיגוטיים הן עבור גרסאות הסיכון הדנ&quot;א סמנים DNA, פולימורפיזמים בדרך כלל קידוד, אשר יכול להבחין תמלילי על בסיס מוצא הכרומוזומים שלהם (איור 1). הסיכון DNA וריאנטים וסמנים DNA לא צריך את תדירות האלל אותו אבל את השלב (haplotypic) מערכת היחסים של סמנים גנטיים צריך להיות מובן. חשוב גם לבחור את סוגי תאים המבטאים את הגן של עניין. פרוטוקול זה מתייחס במיוחד כדי ההליך אימצה לחלץ חומצות גרעין מ fibroblasts אבל השיטה היא החלים באופן שווה על סוגי תאים אחרים, כולל תאים ראשוניים. DNA ו-RNA המחולצים שורות תאים שנבחרו cDNA נוצר. דנ&quot;א cDNA מנותחים עם assay תחל הרחבה, נועד למקד את סמני DNA קידוד 4. Assay הארכת תחל מתבצעת באמצעות (Sequenom) MassARRAY 5 פלטפורמה פי מפרט של היצרן. הארכה מוצרי פריימר מנותחים מכן על ידי לייזר מטריקס בסיוע desorption / שעה יינון של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS). מכיוון סמנים שנבחרו הטרוזיגוטיים הם ייצרו שתי פסגות על פרופילים MS. שטח שיא כל פרופורציונלי שפע התמליל ניתן למדוד עם פונקציה של התוכנה Typer MassARRAY כדי ליצור יחס allelic (אלל 1: אלל 2) החישוב. היחס allelic שהתקבלו cDNA הוא מנורמל באמצעות שמדד מ-DNA גנומי, שם היחס allelic צפוי להיות 1:01 לתקן חפצים טכנית. סמנים עם יחס allelic מנורמל שונה משמעותית 1 לציין כי כמות של תמליל שנוצר משני כרומוזומי באותו תא הוא שונה, דבר המצביע על כך גרסאות ה-DNA הקשורים הפנוטיפ יש השפעה על ביטוי גנים. שולטת ניסויית יש להשתמש כדי לאשר את התוצאות.

Watch this Scientific Journal Video about An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations at JoVE.com

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

עמותות גנטית לעתים קרובות להישאר בלתי מוסבר ברמה התפקודית. שיטה זו נועדה להעריך את ההשפעה של פנוטיפ הקשורים סמנים גנטיים על ידי ניתוח ביטוי גנים בתאים הטרוזיגוטיים SNPs עיבד. הטכנולוגיה מאפשרת מדידה מדויקת של MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה לכמת ספציפי אלל פריימר המוצרים הרחבה.

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

an-allele-specific-gene-expression-assay-to-test-functional-basis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  University of Oxford. עמותות גנטית לעתים קרובות להישאר בלתי מוסבר ברמה התפקודית. שיטה זו נועדה להעריך את ההשפעה של פנוטיפ הקשורים סמנים גנטיים על ידי ניתוח ביטוי גנים בתאים הטרוזיגוטיים SNPs עיבד. הטכנולוגיה מאפשרת מדידה מדויקת של MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה לכמת ספציפי אלל פריימר המוצרים...

Video: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...