نشكر McBryant ستيف وجيف هانسن للحصول على مساعدة تنبيذ فائق وكايزر باتي للمساعدة في التعامل مع الفأرة. المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية في المعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة 5R01NS056379 - 02 تمول هذا العمل.

<html> 1. تنقية وصفها قضبان بريون ويتم تكييف هذا البروتوكول من 18 نشرت سابقا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 غرام من التجانس بريون المصابين أنسجة المخ في 900 مل من الجليد الباردة العازلة المجانسة (HB ، 1X PBS تحتوي على 320 السكروز مم ، 150 مم وكلوريد الصوديوم EDTA 4mM) 1 دقيقة في السرعة القصوى في خلاط التجارية ، ثم 2 دقيقة على الجليد. كرر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جناسة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 XG و 4 درجات مئوية. إزالة وحفظ طاف على الجليد. اعادة تعليق بيليه في HB 1L وكرر الخطوات من 1.1 و 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants سباحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في XG 100000 ، 0 درجة مئوية. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه مخزنة في 100 مل من تريس 1X المالحة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 0.1 ملم و 1 ملي EDTA) التي تحتوي على 2 ٪ تريتون X - 100 (TBST). ويقدر تركيز البروتين من برادفورد أو فحص وضبط مماثلة إلى 5 ملغ / مل في TBST. البرد على الجليد لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في XG 100000 ، 0 درجة مئوية. تجاهل طاف مع بيليه وغسل TBST مل 100 مل (50) ثم TBS. اعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني 1X 100 مل تحتوي على 1 ٪ و sarcosyl كوكتيل مثبط البروتياز ويقلب لمدة 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة العينة على 900 مل من السكروز ملي 320 والطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في XG 100000 ، و 10 درجة مئوية. تجاهل طاف واعادة تعليق بيليه في 10 مل كلوريد الصوديوم 2.3M ، sarcosyl 5 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن عينة 5 × 40 ثانية في القوة القصوى 70 ٪ في فترات دقيقة 1 على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1 مل من العينة في أنابيب الطرد المركزي وإيبندورف لمدة خمس عشرة دقيقة في XG 13000 ، 4oC. غسل الكريات مرتين مع TBS وتخزين @ -70 درجة مئوية أو المتقارن لملون تألقي في الخطوة 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون تألقي المتقارن 1 أنبوب تنقية بريون باستخدام قضبان من 1 فيال DyLight 649 وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل العازلة العلامات DyLight لبرنامج تلفزيوني عن طريق الغسيل الكلوي أو عن طريق الطرد المركزي تصفية الأعمدة. متجر في 20 ميكرولتر aliquots في -70 درجة مئوية بعيدا عن الضوء حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 2. التلقيح بريون والاسترداد الخليوي هذا القسم يشمل التلقيح داخل الصفاق بريون واسترداد خلايا من الغشاء البريتوني ، والعقد اللمفاوية ومنصفي المساريقي والطحال. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع قضبان بريون الفلورسنت 01:50 في برنامج تلفزيوني مباشرة قبل الاستعمال. الماوس القفا من الرقبة الفراء الظهرية مع الإبهام والسبابة ، بدوره الماوس برفق لمواجهة بينك وكبح جماح الاصبع الخنصر مع الذيل. يبسط الماوس ، رفع الجذع الخلفية فوق رأسه ، وعقد معه قليلا رأسا على عقب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة الانسولين 30G ، وضخ 100 ميكرولتر من قضبان بريون الفلورسنت 1 سم من خط الوسط الجانبي والأمامي إلى 1-2 سم المشتركة العجزي الحرقفي. تضاف 1 سم الإبرة من خلال الجلد 45 درجة توجيه إعلامي. استخدام 1:50 التخفيف من الخرز الفلورسنت وحدها أو في برنامج تلفزيوني كما الضوابط. احتضان الفئران عن الوقت المخصص له قبل التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان وافقت لجنة استخدام البروتوكولات. ضخ 10 مل من برنامج تلفزيوني في التجويف البريتوني باستخدام حقنة مل 12 و 25G إبرة. صخرة الذبيحة طوليا برفق لمدة دقيقة واحدة. استرداد تعليق خلية من البريتوني باستخدام الحقنة نفسها و16G إبرة في أنبوب 15 مل المخروطية والاحتياطي على الجليد بينما تشريح الجثة لا يزال مستمرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الجانب البطنية من الذبيحة تماما مع الايثانول 70 ٪. رفع الجلد في خط الوسط أسفل القفص الصدري مع ملقط وقطع صغيرة من خلال شق الجلد مع المقص. بدءا هناك ، وجعل شق الطول 3-5 طويلة عبر الجلد من في كلا الاتجاهين على الرأس والذيل ، ثم اثنين 2 سم ، والشقوق من خط الوسط أفقيا من كل طرف. قشر الظهر ودبوس للجلد للكشف عن تجاويف البريتوني والقفص الصدري. قطع بعناية من خلال أغشية رقيقة شفافة المحيطة الصفاق وتعكس الصدر للكشف عن المنصف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على وإزالة العقد اللمفية المنصفية 2-4 ، الظهرية قليلا أفقيا والمناطق المتاخمة لالغدة الصعترية ، المتاخمة للإعلامي الشريان العضدي الرأسي ، بالقرب من الجانب البطنية من القصبة الهوائية. العثور على وإزالة ما يصل إلى ستة الغدد الليمفاوية المساريقي ، جزءا لا يتجزأ من النسيج المساريقي البيضاء الناعمة التي المراسي الأمعاء لجدار البطن الخلفي. العثور على وإزالة الطحال ، ومظلمة طويلة الجهاز الأحمر الموجود الوحشي فقط من خط الوسط وظهري إلى الأمعاء على الجانب الأيمن من البطن. الغدد الليمفاوية الاحتياطي في 1 مل المتوسط ​​1640 RPMI على الجليد حتى اكتمال التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضعف الصحافة والعقد الليمفاوية من خلال مصفاة شبكة 40 ميكرومتر إلى 3 مل من RPMI في طبق بتري بلاستيكية باستخدام المكبس من حقنة 1 مل. شطف المصفاة مع مل 2 إضافية من RPMI ونقل الخلية 5 مل تعليق لأنبوب مخروطي 15 مل. شطف طبق بيتري مع 5 مل من RPMI إضافية ونقل في أنبوب واحد. الطرد المركزي 5 دقائق عند 250 XG ، تجاهل طاف ، وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل العازلة FACS (1X PBS ، 1 ٪ ألبومين المصل البقري و 10 ملي EDTA) ونقل الى أنبوب 1.5 مل إيبندورف. </li></ol><html> ove_title &quot;&gt; 3. خلية يلطخ والتدفق الخلوي ما يلي هو بروتوكول نموذجي لتحديد تلطيخ فرعية الخلايا المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد الفلورسنت جيدة تتميز المناعة علامات سطح الخلية. وكانت مخففة عن الأجسام المضادة في FACS العازلة مباشرة قبل الاستعمال. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا والخلايا قسامة 10 6 إيبندورف في أنابيب. خلايا جهاز الطرد المركزي (انظر 2.7) ، ويغسل بيليه 2X مع 1 مل FACS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا 20 دقيقة على الجليد في 100 ميليلتر من 2 نانوغرام / مل الفئران الفأر CD16/32 المضادة لمستقبلات القطعة Fc كتلة الذاتية. بيليه وغسل خلايا العازلة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1ng / مل المناسبة الفلورسنت المنشأ (ذ) antibod لكل عينة واحتضان على الثلج لمدة ساعة واحدة. إضافة 100 ميكرولتر من FACS العازلة للخلايا وحده السيطرة. بيليه والخلايا يغسل مرتين مع العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا في ACK العازلة 1 مل (150 ملي NH 4 CL ، 1 ملم KHCO 3 و 0.1 ملي EDTA) احتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة إلى ليز خلايا الدم الحمراء. بيليه وغسل خلايا العازلة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. اعادة تعليق الخلايا في 1 مل FACS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيانات من الخلايا باستخدام عداد الكريات تدفق قادرة على الكشف والتحليل متعدد الألوان ، وعادة مع الليزر 405 ، 488 و 633 نانومتر ، والإثارة 09:55 كشف الانبعاثات مضان. </li></ol> 4. ممثل النتائج : نحن تنقية قضبان بريون من الخام ، وبريون المصابين جناسة الدماغ (الشكل 1) ومنظفات solubilization تنبيذ فائق من الدماغ جناسة E2 الأيائل (حارات 1 و 2) المخصب بدرجة كبيرة لقضبان بريون (قارن الممرات 1 و 3) ، والذي كان أيضا بروتياز K مقاومة (حارة 4). ومن المثير للاهتمام ، عسر الهضم عرض قضبان بريون المنقى التشكيل glycoform مماثلة لافت للنظر لهضم E2 جناسة الدماغ ، مما يشير لتخصيب اليورانيوم المثيرة البريونات. أنتجت مماثل لمعاملة جناسة الدماغ العادي لا PK المقاوم بي ار بي سي (حارات 5 و 6). تحليل تدفق السكان cytometric خلية معينة تثبت أن مستضد تقديم الخلايا موطنا لالبريتوني ساعتين والاحتفاظ الخرز الفلورسنت وقضبان بريون ، كما يتضح من مضان زادت بشكل كبير خلال الضوابط PBS حقن (الشكل 2). لم تحصد من الخلايا في الغشاء البريتوني في برنامج تلفزيوني عرض ضوابط المعالجة أعلاه مضان الخلفية (الشكلان 2A - G) ، بينما الخلايا من حبة (الشكلان 2H - N) وبريون (الشكلان 2O - U) - تلقيح الفئران مضان عرض كبيرة ، خصوصا على حيدات (الشكلان 2I و ف) ، والخلايا الجذعية (الشكلان 2k و R) والضامة (الشكلان 2L و S) ، وبعض العدلات (2J الشكل وس) والخلايا أقل B (2T الشكل). كما عثر على حبة وبريون الحاملة للحيدات ، الخلايا الجذعية والضامة في العقد اللمفية المنصفية ساعتين بعد التلقيح (الشكلان 2AD وبنادق ، وصباحا وAF AG وAN التوالي) ، بينما عدد قليل أو أي بي ار بي CWD الحاملة العدلات ، تم العثور على خلايا T باء أو هناك (الشكلان 2AE و آل ، ه وAG ومنظمة العفو الدولية وأب ، على التوالي). اكتشاف أننا لم الخرز أو قضبان بريون في الطحال أو الغدد الليمفاوية المساريقي (لا تظهر البيانات). جملة وتفصيلا ، وهذه البيانات تظهر أن الخلايا المناعية حركة البريونات مشابه جدا لمستضدات الجسيمات الأخرى. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> ملون تألقي </td><td> LASER الإثارة (نانومتر) </td><td> PEAK الانبعاثات (نانومتر) </td></tr><tr><td> بريون قضبان </td><td> DyLight 649 </td><td> 633 </td><td> 674 </td></tr><tr><td> 1 ميكرون الخرز </td><td> AlexaFluor 660 </td><td> 633 </td><td> 685 </td></tr><tr><td> الأضداد </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CD11b </td><td> eFluor 450 </td><td> 405 </td><td> 450 </td></tr><tr><td></td><td> فيكوإيريترين - Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> R - فيكوإيريترين </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td></td><td> فيكوإيريترين - Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Ly6C </td><td> Fluoroisothiocyante </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> R - فيكوإيريترين </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td> CD21 </td><td> DyLight 488 </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> Allophycocyanin - Cy7 </td><td> 633 </td><td> 785 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> R - فيكوإيريترين </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; الجدول 1. الخصائص الطيفية من الكواشف الفلورسنت <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تنقية بريون من قضبان جناسة الدماغ المصابة. استخدمنا الدماغ الخام 10 ٪ من الغزلان جناسة CWD المصابة (E2 ، الممرات 1and 2) وبدءا من المواد التي نحن تنقية قضبان بريون مجمع (حارات 3 و 4). وأظهرت كل من المواد الخام وتنقيته المقاومة المميزة للبروتياز K العلاج (حارات 1 -- 4) ، في حين العادي جناسة الدماغ لا (حارات 5 و 6). وتظهر علامات الوزن الجزيئي بالدينار إلى اليسار من وصمة عار. BH ، جناسة الدماغ. <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تحليل تدفق cytometric من البريونات الاتجار المناعي خلايا من الصفاق إلى الغدد الليمفاوية المنصفية ساعتين بعد التلقيح. PBS (لوحات وAG AB - V) ، والخرز فلوري (HN وAC - AI) أو قضبان بريون (OU وAJ AP -) كانت حقنها في الصفاق من الفئران والخلايا المأخوذة من السائل غسيل البريتوني (الاتحاد الافريقي) أو الغدد الليمفاوية المنصفية (V - AP) بعد ساعتين. الرسوم البيانية في خلايا العمود العرض الاول من الفئران التي عولجت مع برنامج تلفزيوني (الألواح ألف والخامس) ، والخرز الفلورسنت (لوحة (H) و AC) وقضبان بريون (لوحات وAJ O). يتم رسم الخلايا فلوري (بقع حمراء أو خضراء) ، ومجموع الخلايا (النقاط الرمادية) لإظهار الحجم النسبي (مبعثر إلى الأمام) ، تحبب (مبعثر الجانب) ، ونسبة الخلايا الحية الإجمالي الذي يتألق. الاحتفاظ بأعداد كبيرة من الخلايا المحببة حبات من سمات الفلورسنت وقضبان. وكانت ملطخة أيضا الخلايا مع أجسام مضادة ضد المناعي علامات سطح الخلية وبوابات للLYG - Ly6C + حيدات (لوحات B ، I ، P ، W ، AD والعدالة والتنمية) ، Ly6c - CD11c - CD11b + Ly6G + العدلات (C ، J ، Q ، X ، AE و آل) ، Ly6G - Ly6C - CD11b + CD11c + الخلايا الجذعية (D ، K ، R ، Y ، AF وAM) ، Ly6G - Ly6C - CD11c - CD11b + الضامة ، (E ، L ، S ، Z AG ، وAN) ، CD3 B220 - CD21 + + الخلايا البائية (F ، M ، T ، AA ، ه وAO) و CD21 - B220 - CD3 + الخلايا التائية (G ، N ، U ، AB ، منظمة العفو الدولية وCNN). احتفظ حيدات ، الضامة ، والخلايا الجذعية الخرز الفلورسنت وقضبان بريون في التجويف البريتوني (لوحات وأنا P ، K و L و R و S على التوالي) ونقلهم إلى العقد اللمفية المنصفية (لوحات ميلادي وبنادق ، وصباحا وAF AG وAN ، على التوالي) ، مما يدل على امتصاص مماثلة والاتجار بها هذه الجسيمات اثنين. احتفظ العدلات كمية كبيرة من الخرز (J) وعدد أقل من قضبان (س) ، لكنه فشل في إيصالها إلى الغدد الليمفاوية (AE و آل). احتفظت خلايا باء ونقل بعض قضبان (تي وAO) ، ولكن عمليا لا الخرز (M وه). الخلايا التائية المتجر لا حبات ولا قضبان (N ، U ، منظمة العفو الدولية وCNN).

<ol>
	<li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+B+cells+in+neuroinvasive+scrapie.">A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie.</a> Nature. 390, 687-687 (1997).</li><li>Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+immune+system+in+TSE+pathogenesis.">Involvement of the immune system in TSE pathogenesis.</a> Immunol Today. 19, 201-201 (1998).</li><li>Sigurdson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrP(CWD)+lymphoid+cell+targets+in+early+and+advanced+chronic+wasting+disease+of+mule+deer.">PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer.</a> J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).</li><li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+facilitates+early+prion+pathogenesis.">Complement facilitates early prion pathogenesis.</a> Nat Med. 7, 488-488 (2001).</li><li>Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+complement+component+C3+or+genetic+deficiency+of+C1q+significantly+delays+onset+of+scrapie.">Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie.</a> Nat Med. 7, 485-485 (2001).</li><li>Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Complement+Receptor+CD21/35+Facilitates+Lymphoid+Prion+Colonization+and+Pathogenesis.">Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis.</a> J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).</li><li>Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+delays+lymphoinvasion+after+intraperitonal+scrapie+infection.">Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection.</a> J Virol. 82, 8933-8933 (2008).</li><li>Dorban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+scrapie+infection+modifies+the+homeostasis+of+Peyer's+patches'+dendritic+cells.">Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells.</a> Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).</li><li>Flores-Langarica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+pathogenesis:+the+role+of+complement+C1q+in+scrapie+agent+uptake+by+conventional+dendritic+cells.">Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).</li><li>Huang, F. P., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+oral+transmission+of+prion+diseases.">Dendritic cells and oral transmission of prion diseases.</a> Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).</li><li>Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+dynamics+of+infectious+prion+protein+in+the+intestine.">Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine.</a> Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).</li><li>Aucouturier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+splenic+dendritic+cells+are+sufficient+for+prion+transmission+to+the+CNS+in+mouse+scrapie.">Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie.</a> J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).</li><li>Huang, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+intestinal+dendritic+cells+transport+PrP(Sc)+from+the+gut.">Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut.</a> J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).</li><li>Jeffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapiesusceptible+and+scrapie-resistant+sheep.">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep.</a> J Pathol. 209, 4-4 (2006).</li><li>Raymond, C. R., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+involvement+of+migratory+dendritic+cells+in+the+transfer+of+the+scrapie+agent+from+the+immune+to+peripheral+nervous+systems.">Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems.</a> J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).</li><li>Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+dendritic+cells+acquire+and+degrade+the+scrapie+agent+following+in+vitro+exposure.">Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure.</a> Immunology. 116, 122-122 (2005).</li><li>Gilch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+and+LPS+can+interfere+negatively+with+prion+clearance+in+macrophage+and+microglial+cells.">CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells.</a> FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).</li><li>Safar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass,+biochemical+composition,+and+physicochemical+behavior+of+the+infectious+form+of+the+scrapie+precursor+protein+monomer.">Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).</li><li>B&#252;eler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie.">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73, 1339-1339 (1993).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نحن هنا يبرهن على وجود علامات وبروتوكول للالبريونات تتبع في الجسم الحي الذي يسهل كثيرا رصد الأحداث في وقت مبكر من العدوى بريون الطرفية. هذا البروتوكول يحسن إلى حد كبير على المحاولات السابقة في امتصاص بريون الرصد في المختبر 9 و 3،12 في الجسم الحي...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CWD-infected elk brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Private elk farm in Colorado</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use any non-human prion-infected brain</td>
</tr>
<tr>
<td>Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oster</td>
<td>6694-015</td>
<td>Use any commercial blender</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>SS34 rotor</td>
<td>Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>50.2 Ti rotor</td>
<td>Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Bradford Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B6916</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Misonix</td>
<td>MP4000X</td>
<td>Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power</td>
</tr>
<tr>
<td>DyLight antibody Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>53050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>55430R</td>
<td>Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifugal filter columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>Microcon YM-100</td>
<td>Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff</td>
</tr>
<tr>
<td>8-40 week-old FVB mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River</td>
<td>207</td>
<td>Use any inbred mouse strain</td>
</tr>
<tr>
<td>1 &mu;m red fluorescent beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phosphorex</td>
<td>2307</td>
<td>Use any fluorescent bead &le; 10 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640 medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fluorescent antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>Various</td>
<td>Use any fluorescent antibody appropriate for your application.</td>
</tr>
<tr>
<td>flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dakocytomation</td>
<td>CyanADP</td>
<td>Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection

شكل وجود بروتين بريون الشاذ المضيف ترميز (PrPC) التي يتم البروتيني مقاومة ، ومرضية معدية يميز الأمراض البريونية مثل مرض الهزال المزمن (CWD) من cervids وسكرابي في الأغنام. فرضية بريون تؤكد أن هذا غير طبيعي الملتزم يشكل معظم أو كل من بريون المعدية. لقد كان دور جهاز المناعة في الأحداث في وقت مبكر المرضية بريون الطرفية مقنع لCWD و 1-3 سكرابي. وكشفت الصيدلانية المعدلة وراثيا والدراسات على الفئران دورا هاما في نظام المتممة في الاحتفاظ بها وتكرارها البريونات في وقت مبكر بعد الإصابة 4-6. في التجارب المختبرية والدراسات المجراة وقد لاحظ أيضا الاحتفاظ بريون بواسطة الخلايا الجذعية 7-10 ، على الرغم من أن دورها في الاتجار غير المشروع لا يزال يتضح 11-16. الضامة وبالمثل تورطت في بريون المرضية في وقت مبكر ، ولكن هذه الدراسات ركزت على الأحداث التي وقعت بعد اسابيع من العدوى 3،11،17. هذه الدراسات السابقة تعاني أيضا من مشكلة التمييز بين الذاتية وبي ار بي سي البريونات المعدية. نحن هنا وصف نصف كمي ، ونهج غير متحيز لتقييم امتصاص بريون والاتجار بها من موقع التطعيم من قبل خلايا المناعة المعينين هناك. وتنقية قضبان بريون مجمعة من الدماغ جناسة المصابين solubilization المنظفات غير مجمعة البروتينات وتنبيذ فائق من خلال وسادة السكروز. بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، coomassie الزرقاء تلطيخ والغربية النشاف الانتعاش مؤكدة قضبان بريون عالي التخصيب في كسر مكعبات. وكانت قضبان بريون ملون تألقي المسمى intraperitoneally ثم حقنه في الفئران. بعد ساعتين كان يعاير الخلايا المناعية من السوائل غسيل البريتوني والطحال والغدد الليمفاوية والمنصف للاحتفاظ المساريقي قضيب بريون وفرعية الخلية التي حددتها التدفق الخلوي متعدد الألوان باستخدام علامات لحيدات ، العدلات ، والخلايا الجذعية ، والضامة وباء ، والخلايا التائية. يسمح هذا الاختبار لرصد أول مرة مباشرة من الحصول على الخلايا المناعية والبريونات الاتجار في الجسم الحي في غضون ساعات بعد الإصابة. هذا الاختبار أيضا يفرق بوضوح المعدية ، والبريونات مجمعة من PrPC أعرب عن عادة على الخلايا المضيفة ، والتي يمكن أن يكون صعبا ويؤدي إلى مشاكل تفسير البيانات في أنظمة الفحص الأخرى. ويمكن تكييف هذا البروتوكول إلى طرق التلقيح الأخرى (في الوريد عن طريق الفم ، وintranervous تحت الجلد ، على سبيل المثال) والمستضدات (الخرز مترافق ، ومسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية والطفيلية والبروتينات ، والبيض) كذلك.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection at JoVE.com

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

نحن هنا تصف الرواية مقايسة لرصد امتصاص بريون والاتجار بها من قبل خلايا المناعة فورا بعد التلقيح داخل الصفاق عن طريق تنقية والتوسيم fluorescently قضبان بريون مجمعة من المواد في المخ المصابة ثم رصد واستيعاب الحركة من موقع الحقن وتتميز الخلايا التوسط في هذه الأحداث.

رصد خلايا المناعة الاتجار نيون بريون قضبان وبعد ساعات من العدوى داخل الصفاق

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

monitoring-immune-cells-trafficking-fluorescent-prion-rods-hours

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Colorado State University. نحن هنا تصف الرواية مقايسة لرصد امتصاص بريون والاتجار بها من قبل خلايا المناعة فورا بعد التلقيح داخل الصفاق عن طريق تنقية والتوسيم fluorescently قضبان بريون مجمعة من المواد في المخ المصابة ثم رصد واستيعاب الحركة من موقع الحقن وتتميز الخلايا التوسط في هذه الأحداث.

Video: Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...