Steve McBryant ve Jeff Hansen Biz fare kontrolü ile ilgili yardım için Ultrasantrifügasyon ve Patti Kiser yardım için teşekkür ederim. Ulusal Sağlık Enstitüleri Sinir Hastalıkları ve İnme Ulusal Enstitüsü, hibe 5R01NS056379-02 bu işi finanse edilmektedir.

<html> 1. Prion Çubuklar Arındırıcı ve Etiketleme Bu protokol daha önce yayınlanmış 18 uyarlanmıştır <ol><li> Ticari bir blender maksimum hızda 1 dakika, 2 dakika sonra buz üzerinde buz gibi homojenleştirici tampon 900 mL prion ile enfekte beyin dokusu 100 gram (HB, 320 mM sakkaroz, 150 mM NaCl ve 4mm EDTA içeren 1X PBS) karıştırılır. Üç kez tekrarlayın. </li><li> 3000 xg&#39;de 10 dakika ve 4 ° C Homojenat Santrifüj Çıkarın ve buz üzerinde supernatant kaydetmek. 1L HB pelet yeniden askıya alma ve 1.1 ve 1.2 adımları tekrarlayın. </li><li> 100.000 xg, 0 ° C 60 dakika Havuzu süpernatantlar ve santrifüj Süpernatant atın. </li><li> Yeniden askıya 100 ml 1X Tris pelet tamponlu tuz (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM NaCl ve 1 mM EDTA) içeren% 2 Triton X-100 (TBST). Tahmin Bradford veya benzer tahlil protein konsantrasyonu ve 5 mg / ml TBST ayarlayabilirsiniz. 30 dakika buz üzerinde soğutun. </li><li> 100.000 xg, 0 ° C 30 dakika santrifüj Süpernatant atın ve 50 ml TBST sonra 100 mL TBS ile yıkayın pelet. 100 ml 1X PBS% 1 sarcosyl ve proteaz inhibitörü kokteyl içeren pelet Re-37 az 120 dakika süreyle askıya alma ve heyecan ° C. </li><li> 100.000 xg, 10 ° C, 60 dakika için 320 mM sukroz ve santrifüj 900 mL Katman örnek Süpernatant atın ve 10 ml 2,3 M NaCl içinde yeniden askıya pelet,% 5 sarcosyl. </li><li> Örnek 5 x 40 saniye, 1 dakika aralıklarla buz üzerinde% 70 maksimum güç sonikasyon. </li><li> 13.000 xg, 4oC az on beş dakika için Eppendorf tüpleri ve santrifüj içine örnek kısım 1 ml. TBS ve mağaza ile iki kez yıkayın pelet @ -70 ° C veya adım 1.9 florokrom ile konjuge. </li><li> Prion çubuklar kullanarak DyLight 649 1 şişe saf Konjugat 1 tüp, üretici firmanın protokolüne göre florokrom. </li><li> PBS için filtre sütunları ile diyaliz veya santrifüj Exchange DyLight etiketleme tampon. -70 ° C kullanıma hazır olana kadar uzakta ışıktan 20 mcL alikotları saklayın. </li></ol> 2. Prion Aşılama ve Hücre Kurtarma Bu bölümde, intraperitoneal prion aşılama ve periton, mediastinal ve mezenterik lenf düğümleri ve dalak hücreleri kurtarma kapsar. <ol><li> Kullanımdan hemen önce floresan prion çubuklar PBS ile 1:50 sulandırınız. Başparmak ve işaret parmağı ile dorsal boyun kürk ense fare, hafifçe yüz ve serçe parmak ile kuyruk dizginlemek için fare açmak. Başının üstünde arka gövde yükselten ve onu biraz baş aşağı tutarak, fare Supinate. </li><li> 30G insülin şırınga kullanarak, sakroiliak eklem anterior orta hat ve 1-2 cm 1 cm lateral floresan prion çubuklar 100 mcL enjekte edilir. 1 cm deri yoluyla mediale 45 ° yönetti iğne takın. Kontrol grubu olarak floresan bilyeler veya PBS tek başına 1:50 seyreltme kullanın. Analizden önce ayrılan zaman fareler inkübe edin. </li><li> Onaylanmış hayvan bakımı göre fareler Euthanize ve komite protokollerini kullanmak. PBS 10 ml, 12 ml şırınga ve 25G iğne kullanarak periton boşluğuna enjekte edilir. Bir dakika boyunca hafifçe boyuna karkas sallayın. Karkas diseksiyonu devam ederken, buz üzerinde, 15 ml konik tüp ve yedek aynı şırınga ve 16G iğne kullanarak periton hücre süspansiyonu kurtarın. </li><li> Karkas ventral tarafında% 70 etanol ile iyice ıslatın. Sadece forseps ile göğüs kafesi altındaki orta hat cilt kaldırın ve makas ile deri yoluyla küçük bir kesi kesmek. Her iki ucunda iki orta hatta 2 cm kesiler yanal, daha sonra baş ve kuyruk her iki yönde de deri yoluyla 3-5 cm uzunluğunda bir kesi yapmak, orada başlayarak. Geri Peel ve peritoneal ve torasik boşlukları ortaya çıkarmak için cildi pin. Dikkatle periton çevreleyen ince saydam membranlar kesti ve mediastende ortaya çıkarmak için toraks yansıtacak. </li><li> Trakea ventral kenarında brakiyosefalik arterin medial bitişik timus biraz dorsal ve yanal bitişik 2-4 mediastinal lenf düğümleri,, bulun ve çıkarın. Bulun ve yumuşak beyaz mezenterik dokusunda gömülü altı mezenterik lenf düğümleri, yukarı kaldırmak posterior abdominal duvar çapa bağırsak. Dalak, sadece orta hat ve lateral dorsal karnın sol tarafında bağırsaklarında bulunan uzun, koyu kırmızı organ bulun ve çıkarın. Rezerv lenf düğümleri 1 ml RPMI 1640 orta buz üzerinde diseksiyon tamamlanana kadar. </li><li> 1 ml şırınganın pistonu kullanarak bir plastik Petri kabındaki RPMI 3 mL 40 mikron mesh süzgeç ile ıslatarak yumuşatmak ve lenf düğümleri basın. RPMI ek bir 2 mL süzgeç durulayın ve 15 ml konik bir tüpe 5 ml hücre süspansiyonu transfer. Petri kabı RPMI ek bir 5 ml ile durulayın ve aynı tüp transferi. 250 xg&#39;de 5 dakika santrifüj, 1 ml FACS tampon (1X PBS,% 1 sığır serum albumin ve 10 mM EDTA) supernatant, yeniden askıya hücre pelletini atmak ve 1.5 ml Eppendorf tüp transferi. </li></ol><html> ove_title &quot;&gt; 3 Hücre Boyama ve Sitometrisi Iyi karakterize bağışıklık hücre yüzey belirteçleri karşı floresan antikor kullanarak bağışıklık hücre alt grupları tanımlamak için aşağıdaki tipik bir boyama protokoldür. Tüm antikorlar kullanmadan önce hemen FACS tampon içine seyreltilmiş. <ol><li> Eppendorf tüpleri içine hücreleri ve kısım 10 6 hücre güvenin. Santrifüj hücreleri (2.7) ve 1 ml FACS tamponu ile yıkama pelet 2X. </li><li> Endojen Fc reseptörlerini bloke 2 ng / ml sıçan anti-fare CD16/32 100 mcL hücreleri buz üzerinde 20 dk inkübe edin. Pelet ve FACS tamponu ile yıkama hücreleri. </li><li> Bir saat boyunca her bir örnek ve buz üzerinde inkübe 1ng / ml uygun floresan antikorlarının (y) ler 100 mcL ekleyin. Kontrol hücreleri tek başına FACS tampon 100 mcL ekleyin. Pelet ve iki kez yıkayın hücreleri FACS tampon. </li><li> 1 ml ACK tamponu (NH 4 Cl 150 mM, 1 mM KHCO 3 ve 0.1 mM EDTA), kırmızı kan hücreleri lyse için 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri yeniden askıya . Pelet ve FACS tamponu ile yıkama hücreleri. 1 ml FACS tampon hücreleri yeniden askıya. </li><li> Genellikle 405, 488 ve 633 nm eksitasyon lazerler ve 09:55 floresans emisyon dedektörleri, çok renkli algılama ve analiz yeteneğine sahip bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin veri toplama. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Biz ham prion çubuklar saflaştırılmış, E2 geyik beyin Homojenat (hat 1 ve 2) prion ile enfekte beyin Homojenat (Şekil 1) Deterjan çözünürleştirme ve Ultrasantrifügasyon proteaz K prion çubuklar (1 ve 3 şeritli karşılaştırmak), büyük ölçüde zenginleştirilmiş dirençli (4 şeritli). İlginçtir ki, sindirilmemiş saflaştırılmış prion çubuklar prionlar için dramatik zenginleştirme gösteren çarpıcı bir şekilde sindirilir E2 beyin Homojenat benzer bir glycoform profili görüntülenir. Aynı tedavi normal beyin Homojenat hiçbir PK-dirençli PrP C (şerit 5 ve 6) üretti. Belirli hücre popülasyonlarının Flow sitometrik analizi antijen iki saat periton hücreleri ev sunulması ve floresan boncuk ve prion çubuklar, PBS enjekte kontroller üzerinde dramatik bir artış floresan (Şekil 2) ile kanıtlandığı gibi korumak göstermektedir. Boncuk (Şekil 2H-N) hücreleri ve prion (Şekil 2O-U) inokule önemli floresan görüntülenir fareler ise, arka plan yukarıda floresan (Şekil 2A-G) görüntülenen PBS tedavi kontrolleri periton hasat hücre yok, özellikle monositler (Şekil 2I ve P), dendritik hücreler (Şekil 2K ve R) ve makrofajlar (Şekil 2L ve S) ve bazı Nötrofiller (Şekil 2J ve Q) ve daha az B hücreleri (Şekil 2T). Boncuk ve Prion taşıyan monositler, dendritik hücreler ve makrofajlar da mediastinal lenf düğümleri aşılama (Şekil 2AD ve AK, AF ve AM ve AG ve AN, sırasıyla) ise az ya da hiç PrP CWD taşıyan Nötrofiller iki saat sonra bulundu , B veya T hücreleri (Şekil 2AE ve AL, AH ve AG ve sırasıyla AI ve AP) tespit edilmiştir. Biz herhangi bir boncuk veya prion çubuklar dalak veya mezenterik lenf düğümleri (veriler gösterilmemiştir) tespit edildi. Toto, bu veriler, bağışıklık hücrelerini trafik diğer partikül antijenleri çok benzer prion göstermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> REAKTİF </td><td> Florokrom </td><td> İKAZ LAZER (nm) </td><td> PEAK EMİSYON (nm) </td></tr><tr><td> Prion çubuklar </td><td> DyLight 649 </td><td> 633 </td><td> 674 </td></tr><tr><td> 1 mikron boncuk </td><td> AlexaFluor 660 </td><td> 633 </td><td> 685 </td></tr><tr><td> Antikorlar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CD11b </td><td> eFluor 450 </td><td> 405 </td><td> 450 </td></tr><tr><td></td><td> Fikoeritrin-Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> R-Fikoeritrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td></td><td> Fikoeritrin-Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Ly6C </td><td> Fluoroisothiocyante </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> R-Fikoeritrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td> CD21 </td><td> DyLight 488 </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> Allophycocyanin-Cy7 </td><td> 633 </td><td> 785 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> R-Fikoeritrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; Tablo 1 floresan reaktiflerin spektral özellikleri <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Enfekte beyin Homojenat prion çubuklar Arıtma Biz toplu prion çubuklar (şerit 3 ve 4) saflaştırılmış hangi malzeme başlangıç ​​olarak bir CWD enfekte geyik (E2, şerit 1 ve 2)% 10 ham beyin Homojenat kullandı. Normal beyin Homojenat (şerit 5 ve 6) bulunmamış iken, ham ve arıtılmış malzemeleri proteaz K tedavisi (4 hat 1) için karakteristik bir direnç gösterdi. Molekül ağırlığı işaretleri leke sol Kd gösterilmiştir. BH, beyin Homojenat. <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Aşılama (panelleri AG ve V-AB), floresan boncuk (HN ve AC-AI) veya Prion çubuklar (OU ve AJ-AP) PBS iki saat sonra periton mediastinal lenf düğümleri bağışıklık hücreleri ticareti prionlar Akış sitometrik analizi peritoneal lavaj sıvısı (AU) ya da iki saat sonra mediastinal lenf düğümleri (V-AP) hasat fareler ve hücrelerin periton içine enjekte edilir. PBS (paneller A ve V), floresan boncuk (panel H ve AC) ve prion çubuklar (paneller O ve AJ) ile tedavi edilen farelerden alınan ilk sütunda göstermek hücrelerinde Grafikler. Floresan hücreleri (kırmızı veya yeşil noktalar) ve toplam hücreleri (siyah nokta) göreceli büyüklüğü (forward scatter), taneciklik (yan dağılım) ve floresan toplam canlı hücreler oranı göstermek için çizilir. Granülosit karakteristik hücrelerin önemli sayıda floresan boncuk ve çubuklar korudu. Hücreler aynı zamanda bağışıklık hücre yüzey işaretleyicileri ve LYG-Ly6C + monositler için kapı (panel B, I, P, W, AD ve AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + nötrofil (C, J, Q, X, AE karşı antikor ile boyandı edildi ve AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + dendritik hücreler (D, K, R, Y, AF ve AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + makrofajlar, (E, L, S, Z, AG ve AN), CD3 -B220 + CD21 + B hücreleri (F, M, T, AA, AH ve AO) ve CD21-B220-CD3 + T hücreleri (G, N, U, AB, AI ve AP). Monositler, dendritik hücreler ve makrofajlar floresan boncuk ve prion çubuklar korudu periton boşluğuna (panelleri I ve P, K ve R ve L, G, sırasıyla) ve mediastinal lenf düğümleri (paneller AD ve AK, AF ve AM ve AG taşınan sırasıyla BİR), bu iki parçacık benzer alımı ve ticareti gösteren. Nötrofiller boncuk (J) ve daha az çubukları (S) önemli bir miktarı korunur, ancak lenf düğümleri (AE ve AL) teslim etmek üzere başarısız oldu. B hücreleri ve taşınan bazı çubuklar (T ve AO) ama hemen hemen hiç boncuk (M ve AH) korudu. T hücreleri boncuk ne çubuklar (N, U, AI ve AP) ne kaçırılmaktadır.

<ol>
	<li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+B+cells+in+neuroinvasive+scrapie.">A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie.</a> Nature. 390, 687-687 (1997).</li><li>Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+immune+system+in+TSE+pathogenesis.">Involvement of the immune system in TSE pathogenesis.</a> Immunol Today. 19, 201-201 (1998).</li><li>Sigurdson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrP(CWD)+lymphoid+cell+targets+in+early+and+advanced+chronic+wasting+disease+of+mule+deer.">PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer.</a> J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).</li><li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+facilitates+early+prion+pathogenesis.">Complement facilitates early prion pathogenesis.</a> Nat Med. 7, 488-488 (2001).</li><li>Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+complement+component+C3+or+genetic+deficiency+of+C1q+significantly+delays+onset+of+scrapie.">Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie.</a> Nat Med. 7, 485-485 (2001).</li><li>Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Complement+Receptor+CD21/35+Facilitates+Lymphoid+Prion+Colonization+and+Pathogenesis.">Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis.</a> J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).</li><li>Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+delays+lymphoinvasion+after+intraperitonal+scrapie+infection.">Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection.</a> J Virol. 82, 8933-8933 (2008).</li><li>Dorban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+scrapie+infection+modifies+the+homeostasis+of+Peyer's+patches'+dendritic+cells.">Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells.</a> Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).</li><li>Flores-Langarica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+pathogenesis:+the+role+of+complement+C1q+in+scrapie+agent+uptake+by+conventional+dendritic+cells.">Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).</li><li>Huang, F. P., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+oral+transmission+of+prion+diseases.">Dendritic cells and oral transmission of prion diseases.</a> Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).</li><li>Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+dynamics+of+infectious+prion+protein+in+the+intestine.">Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine.</a> Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).</li><li>Aucouturier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+splenic+dendritic+cells+are+sufficient+for+prion+transmission+to+the+CNS+in+mouse+scrapie.">Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie.</a> J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).</li><li>Huang, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+intestinal+dendritic+cells+transport+PrP(Sc)+from+the+gut.">Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut.</a> J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).</li><li>Jeffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapiesusceptible+and+scrapie-resistant+sheep.">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep.</a> J Pathol. 209, 4-4 (2006).</li><li>Raymond, C. R., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+involvement+of+migratory+dendritic+cells+in+the+transfer+of+the+scrapie+agent+from+the+immune+to+peripheral+nervous+systems.">Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems.</a> J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).</li><li>Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+dendritic+cells+acquire+and+degrade+the+scrapie+agent+following+in+vitro+exposure.">Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure.</a> Immunology. 116, 122-122 (2005).</li><li>Gilch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+and+LPS+can+interfere+negatively+with+prion+clearance+in+macrophage+and+microglial+cells.">CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells.</a> FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).</li><li>Safar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass,+biochemical+composition,+and+physicochemical+behavior+of+the+infectious+form+of+the+scrapie+precursor+protein+monomer.">Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).</li><li>B&#252;eler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie.">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73, 1339-1339 (1993).</li></ol>

Burada periferik prion enfeksiyonu erken olayları büyük ölçüde takibini kolaylaştıran in vivo etiketleme ve izleme prionlar için bir protokol göstermektedir . Bu protokol, net bir şekilde endojen PrP C ayırt etmek için, ön-etiketleme zenginleştirilmiş prion inokulum, in vitro 9 ve in vivo 3,12 izleme prion alımını geçmişte girişimleri büyük ölçüde geliştirir. Çünkü bulaşıcı prionlar ve PrP C aynı birincil amino asit dizilimi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CWD-infected elk brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Private elk farm in Colorado</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use any non-human prion-infected brain</td>
</tr>
<tr>
<td>Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oster</td>
<td>6694-015</td>
<td>Use any commercial blender</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>SS34 rotor</td>
<td>Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>50.2 Ti rotor</td>
<td>Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Bradford Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B6916</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Misonix</td>
<td>MP4000X</td>
<td>Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power</td>
</tr>
<tr>
<td>DyLight antibody Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>53050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>55430R</td>
<td>Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifugal filter columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>Microcon YM-100</td>
<td>Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff</td>
</tr>
<tr>
<td>8-40 week-old FVB mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River</td>
<td>207</td>
<td>Use any inbred mouse strain</td>
</tr>
<tr>
<td>1 &mu;m red fluorescent beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phosphorex</td>
<td>2307</td>
<td>Use any fluorescent bead &le; 10 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640 medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fluorescent antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>Various</td>
<td>Use any fluorescent antibody appropriate for your application.</td>
</tr>
<tr>
<td>flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dakocytomation</td>
<td>CyanADP</td>
<td>Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection

Anormal bir formu varlığı, proteaz, dayanıklı, patolojik ve bulaşıcı bir host-kodlanmış prion proteini (PrPC) Kronik Wasting koyun cervids ve scrapie hastalığı (CWD) olarak prion hastalıkları karakterize etmektedir. Prion hipotez bu anormal conformer çoğu veya tüm bulaşıcı prion teşkil ettiğini ileri sürmektedir. Periferik prion patogenezinde erken olaylar bağışıklık sisteminin rolü ikna edici CWD ve scrapie 1-3 kanıtlanmıştır. Farelerde Transgenik ve farmakolojik çalışmalar sonrası erken dönemde enfeksiyon 4-6 prionlar istinat ve kopyalayan Kompleman sisteminin önemli bir rolü ortaya koymuştur. 7-10 dendritik hücreler tarafından prion tutma gözlemledik in vitro ve in vivo çalışmalar, insan ticareti rollerini olmaya devam etmekle beraber, 11-16 belirsiz. Makrofajlar benzer erken prion patogenezinde suçlanmıştır, ancak bu çalışmalar, enfeksiyon 3,11,17 hafta sonra meydana gelen olaylar üzerine odaklanmıştır . Bu ve önceki çalışmalarda da endojen PrP C ve bulaşıcı prionlar arasındaki farklılıklarda sorun muzdarip. İşte biz orada alınan bağışıklık hücreleri tarafından aşılama sitesinden prion alımı ve ticareti değerlendirmek için bir semikantitatif, tarafsız bir yaklaşım açıklar. Toplulaştırılmış prion çubuklar olmayan toplanan proteinleri ve sakaroz yastık üzerinden Ultrasantrifügasyon deterjan çözünürleştirme ile enfekte beyin Homojenat arınmış. Poliakrilamid jel elektroforezi, Coomassie mavi boyama ve zenginleştirilmiş pelet fraksiyonu prion çubuklar batı blotting teyit kurtarma. Prion çubuklar farelere florokrom-etiketli enjekte intraperitoneal. İki saat sonra, peritoneal lavaj sıvısı, dalak ve mediastinal ve mezenterik lenf düğümleri bağışıklık hücreleri prion çubuk tutma ve monositler, nötrofil, dendritik hücreler, makrofajlar ve B ve T hücreleri için işaretleri kullanarak çok renkli akım sitometri ile tespit edilen hücre alt grupları ölçüldü. Bu testte, enfeksiyondan sonra saat içinde bağışıklık elde hücreleri ve in vivo kaçakçılığı prionlar ilk kez doğrudan izleme sağlar . Bu testte de zor ve diğer test sistemlerinde veri yorumlama sorunları neden olabilir normalde ana hücreleri üzerinde ifade PrPC bulaşıcı, toplu prion, açıkça ayırır. Bu protokol, diğer aşılama yolları (oral, intravenöz, intranervous ve derialtı, örneğin) ve aynı zamanda antijenler (konjuge boncuk, viral, bakteriyel ve paraziter patojenler ve proteinler, yumurta) adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection at JoVE.com

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Burada hemen arındırıcı intraperitoneal aşılama ve floresan sonra enjeksiyon yerinde alımı ve hareket izleme ve bu olaylara aracılık eden hücreler karakterize enfekte beyin malzeme toplanan prion çubuklar etiketleme prion alımı ve ticareti bağışıklık hücreleri tarafından izlenmesi için yeni bir tahlil açıklar.

İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

monitoring-immune-cells-trafficking-fluorescent-prion-rods-hours

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Görüntüleme.  Colorado State University. Burada hemen arındırıcı intraperitoneal aşılama ve floresan sonra enjeksiyon yerinde alımı ve hareket izleme ve bu olaylara aracılık eden hücreler karakterize enfekte beyin malzeme toplanan prion çubuklar etiketleme prion alımı ve ticareti bağışıklık hücreleri tarafından izlenmesi için yeni bir tahlil açıklar.