אנו מודים סטיב McBryant וג&#39;ף הנסן לעזרה עם ultracentrifugation ופאטי קייזר לעזרה בטיפול העכבר. המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ במכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב, להעניק 5R01NS056379-02 מימנה את העבודה הזאת.

<html> 1. טיהור וסימון מוטות Prion פרוטוקול זה מותאם מאחד 18 שפורסם בעבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize 100 גרם של רקמות נגועות הפריון המוח 900 מ&quot;ל של חיץ קרים שמאחד (HB, 1X PBS סוכרוז המכיל 320 מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ ו 4 מ&quot;מ EDTA NaCl) 1 דקות במהירות המרבית בבלנדר מסחרי, ואז 2 דק &#39;על הקרח. חזור שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate דקות 10 XG ב 3000 ו 4 ° C. הסר ולשמור supernatant על הקרח. Re-להשעות גלולה ב 1 ליטר HB וחזור על שלבים 1.1 ו -1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת supernatants ו צנטריפוגות במשך 60 דקות על 100,000 XG, 0 ° C. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה ב 100 מ&quot;ל של 1X טריס בופר סליין (10 mM טריס-HCl, 0.1 mM NaCl ו 1 mM EDTA) המכיל 2% Triton X-100 (TBST). חלבון הערכת הריכוז על ידי ברדפורד או assay דומה ולהתאים 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב TBST. צ&#39;יל על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 100.000 XG, 0 ° C. בטל supernatant ולשטוף עם גלולה TBST 50 מ&quot;ל אז 100 מ&quot;ל כפות. Re-להשעות גלולה של 100 מ&quot;ל 1X PBS sarcosyl המכיל 1% ו מעכב פרוטאז קוקטייל ומערבבים 120 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה על מדגם של 900 מ&quot;ל סוכרוז 320 מ&quot;מ צנטריפוגות במשך 60 דקות על 100,000 XG, 10 ° C. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 10 מ&quot;ל 2.3M NaCl, sarcosyl 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate 5 מדגם x 40 שניות בהספק המרבי 70% במרווחים של 1 דק &#39;על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל של Aliquot מדגם לתוך צינורות Eppendorf ו צנטריפוגות במשך חמש עשרה דקות 13,000 XG, 4oC. שטפו פעמיים עם כדורי כפות ולאחסן @ -70 ° C או המצומד אל fluorochrome בשלב 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד 1 שפופרת של מטוהרים באמצעות מוטות הפריון 1 בקבוקון של 649 DyLight fluorochrome על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי DyLight חיץ תיוג עבור PBS על ידי דיאליזה או צנטריפוגה באמצעות עמודות לסנן. חנות ב 20 aliquots μL ב -70 ° C מן האור עד מוכן לשימוש. </li></ol> 2. Prion הרכבת חיסון ושחזור Cell סעיף זה כולל בתוכו חיסון הפריון intraperitoneal והתאוששות של תאים הצפק, בלוטות הלימפה mediastinal ו mesenteric והטחול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מוטות הפריון פלורסנט 01:50 ב PBS מיד לפני השימוש. עכבר בעורפו על ידי הפרווה הצוואר הגב עם האגודל והאצבע המורה, להפוך את העכבר בעדינות אל פנים אותך ואת לרסן את הזנב עם אצבע הזרת. Supinate העכבר, הרמת פלג הגוף העליון האחוריות מעל הראש ומחזיקה אותו מעט כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק אינסולין 30G, להזריק 100 μL של מוטות הפריון פלורסנט 1 ס&quot;מ לרוחב של קו האמצע ו 1-2 ס&quot;מ קדמית למפרק הע&quot;כ. הכנס את המחט 1 ס&quot;מ דרך העור ביים 45 ° מדיאלית. השתמש 1:50 דילול של חרוזים פלורסנט או PBS לבד כפקדי. דגירה עכברים לזמן המוקצב לפני ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי טיפול בבעלי חיים מאושרים להשתמש בפרוטוקולים הוועדה. הזרק 10 מ&quot;ל של PBS לתוך חלל הצפק באמצעות מזרק 12 מ&quot;ל ו 25 גרם מחט. בעדינות רוק פגר longitudinally למשך דקה אחת. שחזור ההשעיה התא הצפק באמצעות מזרק אותה מחט 16G לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ובמילואים על הקרח בזמן דיסקציה הפגר ממשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב הצד הגחוני של הפגר ביסודיות עם אתנול 70%. הרם את העור על קו האמצע ממש מתחת בית החזה עם מלקחיים ולחתוך חתך קטן דרך העור עם מספריים. החל שם, לעשות חתך 3-5 ס&quot;מ דרך העור מפני בשני הכיוונים ראש וזנב, ולאחר מכן שני 2 ס&quot;מ חתכים של קו האמצע רוחבית מקצה אחד. פיל לאחור להצמיד את העור כדי לחשוף את הבטן ואת החזה חללים. בזהירות לחתוך את קרום שקוף דק המקיף את הצפק ומשקפים את בית החזה כדי לחשוף את חלל החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא ולהסיר 2-4 בלוטות הלימפה mediastinal, הגב מעט וסמוך רוחבית של התימוס, סמוך מדיאלית אל העורק brachiocephalic, ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה. מצא ולהסיר עד שש בלוטות לימפה mesenteric, משובצות ברקמה רכה mesenteric הלבן עוגנים המעיים אל דופן הבטן האחורי. מצא ולהסיר את הטחול, איבר ארוך, אדום כהה ממוקם לרוחב רק של קו האמצע ועל הגב למעי בצד השמאלי של הבטן. בלוטות הלימפה ריזרב 1 בינוני מ&quot;ל 1640 RPMI על הקרח עד לנתיחה תושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרוכך ולחץ בלוטות הלימפה דרך מסננת רשת 40 מיקרומטר תוך 3 מ&quot;ל של RPMI בצלחת פטרי מפלסטיק באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ&quot;ל. לשטוף עם מסננת מ&quot;ל 2 נוסף של RPMI ולהעביר את 5 תא ההשעיה מ&quot;ל לצינור חרוטי 15 מ&quot;ל. יש לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ&quot;ל נוספים של RPMI והעברת צינור זהה. צנטריפוגה 5 דק &#39;ב 250 XG, להשליך supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ&quot;ל FACS חיץ (1X PBS, 1% אלבומין בסרום שור ו 10 mM EDTA) ומעבירים צינור Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. </li></ol><html> ove_title &quot;&gt; 3. Cell מכתים ואת זרימת cytometry להלן פרוטוקול מכתים טיפוסי לזיהוי תת תא החיסון באמצעות נוגדנים נגד ניאון היטב מאופיין סמנים משטח החיסונית התא. הנוגדנים כולם היו בדילול למאגר FACS מיד לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ו -10 aliquot 6 תאים לתוך צינורות Eppendorf. צנטריפוגה תאים (ראו 2.7) ולשטוף גלולה 2X עם חיץ 1 FACS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 20 דקות על קרח μL 100 של העכבר אנטי 2 ng / mL עכברוש CD16/32 לחסום קולטנים Fc אנדוגני. גלולה ותאי לשטוף עם חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של 1ng / mL המתאים פלורסנט antibod (Y) ies לטעום כל לדגור על קרח למשך שעה אחת. הוספת 100 μL של חיץ FACS לבד לתאי הבקרה. גלולה ותאי לשטוף פעמיים עם חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תאים חיץ 1 ACK מ&quot;ל (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 ו - 0.1 mM EDTA) לדגור על קרח דק 1 עד lyse כדוריות דם אדומות. גלולה ותאי לשטוף עם חיץ FACS. Re-להשעות תאים חיץ 1 FACS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים מן התאים באמצעות זרם cytometer מסוגל זיהוי וניתוח ססגוניות, בדרך כלל עם 405, 488 ו - 633 עירור לייזרים ננומטר 09:55 גלאי פליטת הקרינה. </li></ol> 4. נציג תוצאות: אנו מטוהרים מוטות הפריון מ גולמי, הפריון נגועים homogenate המוח (איור 1) solubilization דטרגנט ו ultracentrifugation של איילים E2 homogenate במוח (מסלולים 1 ו -2) העשירו מאוד עבור מוטות Prion (להשוות מסלולים 1 ו - 3), אשר היה גם פרוטאז K עמיד (מסלול 4). מעניין, לא מעוכל מוטות הפריון מטוהרים מוצג פרופיל glycoform דומה להדהים homogenate מתעכל במוח E2, המציין העשרה דרמטי עבור פריונים. זהים שטופלו homogenate מוח נורמלי לא הניבה שום קי עמיד PRP C (נתיבי 5 ו -6). ניתוח תזרים cytometric של אוכלוסיות תאים ספציפיים להוכיח כי התאים המציגים אנטיגנים הביתה הצפק על ידי שעתיים לשמור חרוזים ומוטות ניאון Prion, כפי שמעידים הקרינה גדל באופן דרמטי על שולטת PBS מוזרק (איור 2). לא התאים שנקטפו מן הצפק של PBS שטופלו שולטת מוצגים פלואורסצנטי מעל הרקע (איורים 2A-G), ואילו התאים חרוז (איורים 2H-N) הפריון (איורים 2O-U)-מחוסן עכברים מוצג הקרינה משמעותית, בעיקר על מונוציטים (איורים 2i ו-P), תאים דנדריטים (איורים 2k ו R) ומקרופגים (איורים 2L ו-S), וכמה נויטרופילים (איור 2J ו-Q) ותאי B פחות (2T איור). חרוז Prion נושאות מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופגים נמצאו גם את בלוטות הלימפה mediastinal שעתיים לאחר חיסון (איורים 2AD ו AK, AF ו - AM ו AG ו -, בהתאמה), בעוד מעט או לא PRP CWD נושאות נויטרופילים , בתאי B או T נמצאו שם (איורים 2AE ו AL, AH ו AG ו-AI ו AP, בהתאמה). גילינו שאין חרוזים או מוטות הפריון הטחול או בלוטות לימפה mesenteric (מידע לא מוצג). בשנת טוטו, נתונים אלו מראים כי תאים חיסוניים תנועה פריונים מאוד דומה אנטיגנים חלקיקים אחרים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> FLUOROCHROME </td><td> עירור לייזר (ננומטר) </td><td> שיא הפליטה (ננומטר) </td></tr><tr><td> Prion מוטות </td><td> DyLight 649 </td><td> 633 </td><td> 674 </td></tr><tr><td> 1 מיקרומטר חרוזים </td><td> AlexaFluor 660 </td><td> 633 </td><td> 685 </td></tr><tr><td> נוגדנים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CD11b </td><td> eFluor 450 </td><td> 405 </td><td> 450 </td></tr><tr><td></td><td> Phycoerythrin-Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> R-Phycoerythrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td></td><td> Phycoerythrin-Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Ly6C </td><td> Fluoroisothiocyante </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> R-Phycoerythrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td> CD21 </td><td> DyLight 488 </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> Allophycocyanin-Cy7 </td><td> 633 </td><td> 785 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> R-Phycoerythrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; בטבלה 1. תכונות ספקטרליות של ריאגנטים פלורסנט <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. טיהור של מוטות הפריון מ homogenate במוח נגועים. השתמשנו במוח של 10% homogenate גולמי צבי CWD נגועים (E2, נתיבי 1and 2) כמו התחלה החומר שממנו אנו מטוהרים מוטות הפריון מצטברים (מסלולים 3 ו -4). שני גולמי וחומרי מטוהרים הראה התנגדות מאפיין פרוטאז K הטיפול (נתיבי 1 - 4), ואילו homogenate מוח נורמלי לא (נתיבי 5 ו -6). סמנים משקל מולקולרי מוצגים Kd משמאל כתם. BH, homogenate המוח. <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניתוח תזרים cytometric פריונים של תאים חיסוניים סחר מ הצפק לבלוטות הלימפה mediastinal שעתיים לאחר חיסון. PBS (לוחות AG ו-V-AB), חרוזי ניאון (ח&quot;נ ו AC-AI) או מוטות Prion (OU ו AJ-AP) היו מוזרק הצפק של עכברים לתאים שנקטפו מן נוזל שטיפה פריטוניאלית (AU) או בלוטות הלימפה mediastinal (V-AP) כעבור שעתיים. גרפים במופע התאים הראשונים בטור מן העכברים שטופלו PBS (פאנלים ו-V), חרוזי ניאון (פאנל H ו-AC) ומוטות Prion (לוחות O ו AJ). תאים פלורסנט (נקודות אדומות או ירוקות) ותאי הכולל (נקודות אפורות) הם זממו להראות גודלו היחסי (פיזור קדימה), גרעיניות (פיזור צד) ואת חלקם של תאים חיים הכולל לזרוח. מספר רב של תאים אופייני גרנולוציטים שמר חרוזים ומוטות ניאון. תאים הוכתמו גם עם נוגדנים כנגד החיסון משטח סמנים התא מגודרת עבור LyG-Ly6C + מונוציטים (לוחות B, I, P, W, AD ו AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + נויטרופילים (C, J, Q, X, AE ואל), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + תאים דנדריטים (D, K, R, Y, AF ו - PM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + מקרופאגים, (E, L, S, Z, AG ו), CD3 -B220 + CD21 + B-תאים (F, M, T, AA, AH ו AO) ו CD21-B220-CD3 + ותאי T (G, N, U, AB, ו-AI AP). מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופגים שמר חרוזים ומוטות ניאון הפריון של חלל הצפק (פאנלים אני ו-P, K ו-R ו-L ו-S בהתאמה) והעבירו אותם לבלוטות הלימפה mediastinal (לוחות לספירה ו AK, AF ו - AM ו AG וכן, בהתאמה), הוכחת ספיגת סחר דומים של שני חלקיקים. נויטרופילים שמר כמות משמעותית של חרוזים (J) ומוטות פחות (Q), אך לא הצליחו לספק להם בלוטות הלימפה (AE ו AL). בתאי B שמרו והעבירו כמה מוטות (T ו-AO), אך כמעט ללא חרוזים (M ו-AH). בתאי T נסחרות לא חרוזים ולא מוטות (N, U, ו-AI AP).

<ol>
	<li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+B+cells+in+neuroinvasive+scrapie.">A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie.</a> Nature. 390, 687-687 (1997).</li><li>Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+immune+system+in+TSE+pathogenesis.">Involvement of the immune system in TSE pathogenesis.</a> Immunol Today. 19, 201-201 (1998).</li><li>Sigurdson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrP(CWD)+lymphoid+cell+targets+in+early+and+advanced+chronic+wasting+disease+of+mule+deer.">PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer.</a> J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).</li><li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+facilitates+early+prion+pathogenesis.">Complement facilitates early prion pathogenesis.</a> Nat Med. 7, 488-488 (2001).</li><li>Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+complement+component+C3+or+genetic+deficiency+of+C1q+significantly+delays+onset+of+scrapie.">Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie.</a> Nat Med. 7, 485-485 (2001).</li><li>Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Complement+Receptor+CD21/35+Facilitates+Lymphoid+Prion+Colonization+and+Pathogenesis.">Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis.</a> J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).</li><li>Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+delays+lymphoinvasion+after+intraperitonal+scrapie+infection.">Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection.</a> J Virol. 82, 8933-8933 (2008).</li><li>Dorban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+scrapie+infection+modifies+the+homeostasis+of+Peyer's+patches'+dendritic+cells.">Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells.</a> Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).</li><li>Flores-Langarica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+pathogenesis:+the+role+of+complement+C1q+in+scrapie+agent+uptake+by+conventional+dendritic+cells.">Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).</li><li>Huang, F. P., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+oral+transmission+of+prion+diseases.">Dendritic cells and oral transmission of prion diseases.</a> Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).</li><li>Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+dynamics+of+infectious+prion+protein+in+the+intestine.">Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine.</a> Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).</li><li>Aucouturier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+splenic+dendritic+cells+are+sufficient+for+prion+transmission+to+the+CNS+in+mouse+scrapie.">Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie.</a> J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).</li><li>Huang, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+intestinal+dendritic+cells+transport+PrP(Sc)+from+the+gut.">Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut.</a> J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).</li><li>Jeffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapiesusceptible+and+scrapie-resistant+sheep.">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep.</a> J Pathol. 209, 4-4 (2006).</li><li>Raymond, C. R., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+involvement+of+migratory+dendritic+cells+in+the+transfer+of+the+scrapie+agent+from+the+immune+to+peripheral+nervous+systems.">Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems.</a> J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).</li><li>Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+dendritic+cells+acquire+and+degrade+the+scrapie+agent+following+in+vitro+exposure.">Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure.</a> Immunology. 116, 122-122 (2005).</li><li>Gilch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+and+LPS+can+interfere+negatively+with+prion+clearance+in+macrophage+and+microglial+cells.">CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells.</a> FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).</li><li>Safar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass,+biochemical+composition,+and+physicochemical+behavior+of+the+infectious+form+of+the+scrapie+precursor+protein+monomer.">Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).</li><li>B&#252;eler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie.">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73, 1339-1339 (1993).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן אנו מדגימים פרוטוקול תיוג פריונים מעקב in vivo זה מאוד מקל על ניטור אירועים בתחילת זיהום הפריון היקפי. פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי על ניסיונות העבר על ספיגת הפריון ניטור במבחנה 9 ו - in vivo על ידי 3,12 inoculum מראש תיוג הפריון מועשר באופן חד משמע...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CWD-infected elk brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Private elk farm in Colorado</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use any non-human prion-infected brain</td>
</tr>
<tr>
<td>Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oster</td>
<td>6694-015</td>
<td>Use any commercial blender</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>SS34 rotor</td>
<td>Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>50.2 Ti rotor</td>
<td>Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Bradford Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B6916</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Misonix</td>
<td>MP4000X</td>
<td>Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power</td>
</tr>
<tr>
<td>DyLight antibody Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>53050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>55430R</td>
<td>Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifugal filter columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>Microcon YM-100</td>
<td>Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff</td>
</tr>
<tr>
<td>8-40 week-old FVB mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River</td>
<td>207</td>
<td>Use any inbred mouse strain</td>
</tr>
<tr>
<td>1 &mu;m red fluorescent beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phosphorex</td>
<td>2307</td>
<td>Use any fluorescent bead &le; 10 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640 medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fluorescent antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>Various</td>
<td>Use any fluorescent antibody appropriate for your application.</td>
</tr>
<tr>
<td>flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dakocytomation</td>
<td>CyanADP</td>
<td>Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection

נוכחות של צורה חריגה חלבון מארח בקידוד Prion (PrPC) כי הוא פרוטאז עמידים, פתולוגיים ו זיהומיות המאפיינת מחלות Prion כגון מחלות כרוניות בזבוז (CWD) של cervids ו scrapie בכבשים. ההשערה Prion טוען כי זה לא נורמלי conformer מהווה רוב או את כל הפריון זיהומיות. תפקידה של המערכת החיסונית באירועים מוקדם בפתוגנזה הפריון היקפי הודגמה באופן משכנע עבור CWD ו scrapie 1-3. טראנסגנטי ו תרופתי מחקרים בעכברים גילה תפקיד חשוב של המערכת משלים שמירה פריונים משכפלים מוקדם לאחר ההדבקה 4-6. במבחנה במחקרים vivo הבחינו גם שימור הפריון על ידי תאים דנדריטים 7-10, למרות תפקידם בסחר נשאר ברור 11-16. המקרופאגים יש דומה היה מעורב בפתוגנזה הפריון מוקדם, אך מחקרים אלה התמקדו אירועים המתרחשים שבועות לאחר ההדבקה 3,11,17. אלה מחקרים קודמים גם סובלים מבעיה של הבחנה בין אנדוגני PRP C ו פריונים זיהומיות. כאן אנו מתארים גישה semiquantitative, משוחדת להערכת ספיגת הפריון וסחר מהאתר חיסון על ידי תאים חיסוניים גייסו שם. מוטות הפריון המצטברים היו מטוהרים מן homogenate המוח נגוע solubilization ניקוי שאינם מצטברים חלבונים ultracentrifugation באמצעות כרית סוכרוז. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide, coomassie מכתים כחול המערבי התאוששות אישרו סופג מוטות הפריון מועשר בשבריר pelleted. מוטות Prion היו intraperitoneally מוזרק אז fluorochrome שכותרתו לעכברים. שעתיים אחר כך תאים חיסוניים מנוזל שטיפה פריטוניאלית טחול, ובלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric היו assayed עבור החזקת הפריון מוט תת תא מזוהה על ידי זרימת cytometry ססגוניות באמצעות סמנים עבור מונוציטים, נויטרופילים, התאים הדנדריטים, מקרופאגים ו-B ותאי T. Assay זה מאפשר ניטור הפעם הראשונה הישירה של תאים חיסוניים רכישה פריונים סחר in vivo בתוך שעות לאחר ההדבקה. Assay זה גם ברור מבדיל זיהומיות, פריונים מצטבר של PrPC לידי ביטוי בדרך כלל על תאים המארח, אשר יכול להיות קשה להוביל לבעיות נתונים לפרשנות במערכות assay אחרים. פרוטוקול זה ניתן להתאים מסלולים חיסון אחר (דרך הפה, דרך הווריד, intranervous ואת תת עורי, למשל) ואת אנטיגנים (חרוזים מצומדות, פתוגנים חיידקיים, נגיפיים טפילי וחלבונים, ביצה) וכן.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection at JoVE.com

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

כאן אנו מתארים assay הרומן לניטור ספיגת הפריון וסחר על ידי תאים חיסוניים מיד לאחר חיסון intraperitoneal ידי מטהרים fluorescently תיוג מוטות הפריון מצטבר חומר במוח נגועים אז ניטור ספיגת שלהם תנועה מאתר ההזרקה ואפיון התאים לתווך את האירועים הללו.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

monitoring-immune-cells-trafficking-fluorescent-prion-rods-hours

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Colorado State University. כאן אנו מתארים assay הרומן לניטור ספיגת הפריון וסחר על ידי תאים חיסוניים מיד לאחר חיסון intraperitoneal ידי מטהרים fluorescently תיוג מוטות הפריון מצטבר חומר במוח נגועים אז ניטור ספיגת שלהם תנועה מאתר ההזרקה ואפיון התאים לתווך את האירועים הללו.

Video: Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...