1. التجمع من تدفق النظام الخليوي مع جميع مكونات نظام تدفق تجميعها ويشمل : أنابيب autoclavable والفخاخ فقاعة ، وزجاجة المتوسطة / النفايات وخلايا تدفق كما هو مبين في الشكل 1. ويمكن إعادة استخدام جميع هذه الأجزاء بين التجارب. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الإعداد لنظام خلية تدفق (المكونات الأساسية من الإعداد). نظام تدفق خلية تتكون من عدة عناصر : زجاجة المتوسطة ومضخة تمعجية ، والفخاخ فقاعة ، الخلية التدفق ، وزجاجة من النفايات ، ومختلف القطاعات من الأنابيب المترابطة بواسطة الروابط المختلفة. الرقم المقدم من قبل تتكرم Lyngklip رون. 2. جمعية خلية تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التعامل مع تدفق الخلية (الشكل 2A) مع ممرات رقيقة من السيليكون الغراء ، وذلك باستخدام المحاقن (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان زلة تغطية على رأس خطوط سيليكون (الشكل 3). وتستخدم ينزلق الغطاء الزجاجي كما التحتية للP. الزنجارية بينما يتم تطبيق زلات لتغطية البلاستيكية S. الجعوية بيوفيلم. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. رسم تخطيطي لخلية تدفق وفخ فقاعة 2. وصف تفصيلي للأبعاد المستخدمة لإنتاج فخ التدفق) فقاعة الخلية ب) ، DTU بيولوجيا الأنظمة. طبع بإذن من جون وايلي وأولاده المحدودة ، (وكان عنوانه سابقا DTU Biocentrum بيولوجيا الأنظمة ، كما هو مبين في الشكل) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. توضيحات من خطوط سيليكون تطبيق الغراء لتعلق التحتية الزجاج. يتم وضع غطاء من الزجاج وأشار خلال الغراء سيليكون لإرفاقه الخلية التدفق. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره الخلية تدفق أكثر من وضعه على سطح مستو مع تغطية الجانب الانزلاق إلى أسفل. اضغط برفق على الجزء الخلفي للخلية تدفق لدفع زلة تغطية على قاعدة الخلية التدفق. بدوره على تدفق الخلية وتفتيش للمناطق التي لا مختومة بختم السيليكون. ويمكن استخدام مقبض (مكبس) جزءا من حقنة كأداة للضغط برفق الخلية الزجاجية وتدفق معا. </li></ol> 3. زجاجة المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب السيليكون التغذية (2 مم الداخلية) في زجاجة والمتوسطة وإدراج رابط مباشرة في الطرف الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى الزجاجة المتوسطة (انظر المتوسطة للمحتوى &quot;وسائل الاعلام&quot; الفقرة) موصل غطاء الزجاجة وبرقائق معدنية والأوتوكلاف المتوسط. قد تأكد من أن يتم إصلاح نهاية أنبوب إمداد فوق مستوى السائل في زجاجة المتوسطة أو تأثير سيفون الزجاجة الفارغة المتوسطة عند التعقيم. </li></ol> 4. ربط فقاعة خلية فخ التدفق ، ومضخة تجميع كل الأنابيب وفقا للمخطط في الشكل 1. استخدام أنابيب من السيليكون ، باستثناء الجزء الذي يمر عبر مضخة تمعجية حيث يتم تطبيق أنابيب Marprene. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل توصيل أنبوب من الزجاجة المتوسطة لجميع غرف تدفق الفردية ، وتقسيم أنبوب إلى العدد المطلوب من المنافذ التي طبقت في التجربة. استخدام T - الموصلات لجعل عدد مرغوب فيه من أنابيب اتصال من أنبوب تغذية للأنابيب Marprene في مضخة (انظر الشكل 1 ، T - الموصل). ومن المسلم به عموما فكرة جيدة للحفاظ على النظام نفس تسلسل الأنابيب وتدفق الخلايا في جميع أنحاء النظام ، لتسهيل التعرف على المكونات في حالة من الخلل في النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط كل أنبوب تغذية الفردية (2 مليمتر في القطر) لMarprene الأنابيب في المضخة باستخدام موصلات مستقيمة. توصيل أنابيب Marprene إلى فخ فقاعة (الشكل 2B) عبر أنبوب السيليكون الوسيطة (1 مليمتر في القطر). تأكد من أن يتم توصيل المضخة إلى مدخل على أطول جزء من فخ الفقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنبوب مخرج الناتجة من الفخاخ فقاعة لتدفق مدخل الخلية (1 مليمتر في القطر) ، تأكد من أن طول هذه الأنابيب يسمح بنقل خلية تدفق إلى مرحلة المجهر مبائر (عادة 1 م). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الحقن 5 مل على رأس الفخاخ الفقاعة. وثيق مع قمم القبعات مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على تدفق منفذ توصيل الخلية باختصار ، ما يقرب من 40 ملم قطعة من (1 مليمتر في القطر) ، وأنابيب واستخدام &quot;خفض&quot; موصل مباشرة إلى نعلق أنبوب النفايات (2 مم في القطر) بطول الحاجة. مكان أنابيب النفايات في حاوية النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأهم ، يجب دائما أن تكون حاوية النفايات وضعها في نفس مستوى تدفق الخلايا ، أبدا دون تدفق الخلايا المستوى. أيضا ، تأكد من أن يتم إصلاح في نهاية أنابيب النفايات فوق المستوى المتوقع من النفايات السائلة لتجنب تدفق الى الوراء بسبب تأثير سيفون عند التعامل مع تدفق الخلايا. </li></ol> 5. تعقيم وغسل نظام تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القبعات فخ فقاعة ووضعها في الإيثانول 70 ٪ لإبقائها عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعمل بسرعة أعلى مضخة لملء النظام مع 0.5 ٪ (V / V) هيبوكلوريت الصوديوم في المياه &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القبعات فخ فقاعة الخلف على عندما تمتلئ تماما الفخاخ الفقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستفادة من تدفق لإزالة الخلايا فقاعات في غرفة التدفق. الحرص على عدم الاضرار الزجاج غطاء هشا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح هذا النظام لتعقيم لح 3-4 في معدل التدفق من 3 مل / ح / قناة (0.2 مم / ثانية معدل التدفق الخطية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل النظام 2-3 مرات لغسل كل هيبوكلوريت. ملء وتفريغ النظام مع الماء المعقم. يجب أن تفرغ تماما فقاعة الفخاخ بين كل غسل. ويمكن القيام بذلك عن طريق الضخ في الهواء حتى يتم تفريغ الفخاخ الفقاعة. بعد تفريغ وإزالة الحدود القصوى من الفخاخ فقاعة قبل إعادة تعبئتها النظام. استبدال قبعات بعد الفخاخ فقاعة مملوءة تماما مع السائل. كرر كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المياه المعقمة من خلال النظام في معدل تدفق منخفض (1-3 مل / ح / القناة) خلال الليل أو الانتقال إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال الزجاجة المتوسطة على مدخل ومطاردة النظام مع أكثر من ليلة المتوسطة في معدل تدفق منخفض (3 مل / ح / القناة) في درجة الحرارة ، حيث سيتم تنفيذ التجربة. ملاحظة : يجب إفراغ فقاعة الفخاخ للمياه قبل ملء النظام مع المتوسط. </li></ol> 6. تلقيح من CELL FLOW <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين عشية وضحاها من ثقافة إلى جعل تخفيف كثافة ضوئية المطلوب (على سبيل المثال لالزنجارية P. OD ل 600Nm 0.001 و 0.1 OD ل 600Nm للخميرة س). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة 0.5 مل مع إبرة 27G لتحميل قيحة ما يكفي لملء الغرفة. 250 ميكرولتر كافية لغرف تدفق جود أبعاد المحددة في هذا العمل (الشكل 2. و 40 ملم x 4 مم × 1 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف ضخ تمعجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك قبالة أنابيب السيليكون مما أدى إلى تدفق الخلية لمنع تدفق الظهر في النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الموقع على التلقيح بواسطة أنبوب السيليكون المسح مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة في أنبوب السيليكون وإدخال طرف في مدخل الخلية التدفق. حقن اللقاح ببطء الى غرفة (يجب الحرص على عدم ضخ فقاعات الهواء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة ويمسح مكان الحقن مع الايثانول 70 ٪ تليها الختم على الفور ثقب سيليكون باستخدام الغراء على موقع الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تدفق الخلية ، والسماح للالكائنات الدقيقة التمسك التحتية لمدة 1 ساعة دون تدفق من خلال الخلية التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره الخلية التدفق ، وبدء ضخ المتوسطة (3 مل / ح / قناة) واتخاذ المشبك قبالة أنبوب السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع نظام للحضانة ، على 37 درجة مئوية في حالة P. الزنجارية و 30 درجة مئوية في حالة س. خميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن بيوفيلم في غرف تدفق تكون الآن تصور عن طريق CLSM. </li></ol> 7. تلون بيوفيلم للفحص المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيف من تلطيخ المناسب (على سبيل المثال 1:1000 Syto 9 يعيش وصمة عار للخميرة س.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف ضخ تمعجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك لانابيب سيليكون المؤدية إلى الخلية التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم موقع التلقيح في الأنبوب سيليكون بواسطة المسح مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة 0.5 مل مع إبرة 27G لتحميل ما يكفي لملء حل تلوين الغرفة. 250 ميكرولتر كافية لغرف تدفق المستخدمة هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة في أنبوب السيليكون وإدخال طرف في مدخل الخلية التدفق. حقن ببطء الحل تلطيخ في الغرفة (يجب الحرص على عدم ضخ فقاعات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة ويمسح مكان الحقن مع الايثانول 70 ٪ تليها الختم على الفور في موقع الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلية دون تدفق تدفق لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع المشبك وبدء تدفق (3 مل / ح / قناة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات مع CLSM </li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li><li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li><li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لقد أثبتنا نظام تدفق الخلية ، التي تمثل أداة قوية في التحقيقات بيوفيلم. جنبا إلى جنب مع التصوير 3D بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، ونظام لديها مجموعة من المزايا بالمقارنة مع غيرها من أساليب تحليل الأغشية الحيوية الميكروبية عن طريق التقنيات المجهرية أكثر تقليدية. هذا النظام يسمح التصور 3D معيشة المجتمعات بيوفيلم الجرثومية دون اضطراب في المجتمع. وسوف المجهر الضوئي لم تقدم معلومات مفصلة حول منافذ للبيوفيلم وبينما يوفر القرار المجهر الإلكتروني النانو من بيوفيلم ، فإنه لا يسمح يعيش التصوير الخلية. استخدام قناة تدفق وصف النظام لدينا سابقا توضيح التوزيع المكاني للالخلايا البكتيرية للمضادات الحيوية الحساسة عدة 5-8 (الشكل 4A) ، وتوزيع المركبات خارج الخلية ، مثل الحمض النووي 11/09 ، وتوزيع خلايا متحركة وغير متحركة ، من نفس النوع داخل المجتمع البكتيرية 4،6،9 (الشكل 4C). ونحن نتصور أنه يمكن استخدام نظام تدفق خلية لدراسة جوانب من الأغشية الحيوية الخميرة. قد يكون هذا التوزيع المكانية الزمانية للبيوفيلم الخميرة استجابة لعوامل بيئية مثل الفطريات ، وكذلك التعرف على الجينات المسؤولة عن التنمية بيوفيلم الخميرة. رغم أنها ليست معروفة الخميرة على التمايز إلى خلايا متحركة وغير متحركة ، قد جوانب أخرى من تنويع بيوفيلم أن مثل هذه الدراسات حيث أن التحول المورفولوجي لخلايا الخميرة من الكاذبة ، والتحول إلى خلايا من فرداني ضعفاني. لقد أظهرنا النظام الذي يتوافق مع العديد من الأنواع الميكروبية ، وسوف تعمل مع عدة تقنيات التلوين. مجموعة متنوعة من تلطيخ تحقيقات مختلفة والبروتينات الفلورية ، مثل GFP ، تمكين التحقيقات مكانة معينة في بيوفيلم النامية وأداة فعالة في تحليل تأثير العوامل المضادة للميكروبات أو عوامل بيئية أخرى. المعلومات التي يمكن الحصول عليها هو مفصل جدا (الشكل 4) ، ويمكن أن يكون كميا الميزات في بيوفيلم مع برامج الكمبيوتر مثل COMSTAT 12،13. عموما ، فإن الجانب الأكثر أهمية من البروتوكول هو حقيقة أنها هي عملية تستغرق وقتا طويلا. بل هو أيضا وجود قيود على الخلايا التي تحتاج إلى أن تكون قادرة على النمو على سطح غير الفلورسنت شفافة. . منذ يتم تحليل بيوفيلم تشكيلها باستخدام المجهر متحد البؤر ، وعمق التحقيق التي يمكن أن يقتصر على بضع مئات ميكرومتر 14 هناك مزيد من القيود التقنية المتأصلة في التصميم : ليست مناسبة لنظام الفرز إنتاجية عالية ، وخبرة الباحث يمكن التعامل في معظم القنوات نحو 15 في التجربة ، والتي بدورها يمكن أن تستغرق عدة أيام للاستعداد. ومع ذلك ، يمكن للمضادات الحيوية أو المسوخ التي تعتبر ذات صلة للدراسات بيوفيلم في البداية فحص شامل لأساليب أخرى مثل تلطيخ البنفسجي الكريستال قبل أن يتم نقل المرشحين الأكثر إثارة للاهتمام لتدفق نظام الخلية. الأوراق والزجاج غطاء هي رقيقة جدا وكسر بسهولة ، وينبغي توخي الحذر عند التعامل مع النظم. وينبغي أن تدرس بالإضافة الأنبوب اليومية خلال تشغيل للتجربة ، لأن قدرا كبيرا من &quot;العودة الى تحقيق النمو&quot; في أنابيب مدخل المنبع فقط من الخلايا يمكن أن يحدث تدفق. يمكن حلها عن طريق إزالة هذا التلوث عدة سنتيمترات من أنبوب السيليكون من الجانب مدخل تدفق الخلايا ، وذلك باستخدام تقنية معقمة. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الرقم 4 (أ) PAO1) 4 ايام العمر -- GFP بيوفيلم للتعامل مع 24H كوليستين ويوديد Propidium لتلطيخ القتلى (الأحمر وصمة عار) ب) العرض 3D لمدة ثلاثة أيام P. القديمة PAO1 الزنجارية (P. الزنجارية نوع البرية) -- GFP بيوفيلم 6 ج) 3D عرض صورة لPAO1 -- بيلا CFP متحولة (الأزرق) مع YFP PAO1 نوع البرية (الصفراء) د) 5 ايام PAO1 القديمة -- GFP بيوفيلم قدمت بوصفها 3D ه صورة) 26 ح س. البيرة (PTR3 متحولة في الخلفية CEN.PK) بيوفيلم ملطخة Syto - 9 15.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقاعة الفخاخ والبولي ايثلين (DTU بيولوجيا الأنظمة والتقنية جامعة الدنمارك ، http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Setup.aspx 20Center/Resources/Biofilm ٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضح الموصلات البلاستيكية من البولي بروبلين وT - الموصلات (كول Parmer ، 1 / ​​8 بوصة (3.175 ملم) و 1 / 16 بوصة (1.588 ملم)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشابك </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبائر المجهر (زايس ، وميتا LSM510) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips والزجاج (Knittel جلاسر) 50 × 24 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips ، بولي كلوريد الفينيل coverslips (Rinzl) 50 × 24 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق الخلايا والبولي ايثلين (DTU بيولوجيا الأنظمة والتقنية جامعة الدنمارك ، http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Setup.aspx ٪ 20Center/Resources/Biofilm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسطة الزجاجات (شوت) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضخة تمعجية (واطسون ، مارلو ، 205S) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتداول السلة للنظم ومضخات التدفق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيليكون الغراء (3M سيليكون مانع التسرب السوبر واضح) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة 5 مل (Terumo) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Syto 9 (المسابر الجزيئية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مل المحاقن مع الإبر (27G ، Terumo LU - 100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاوية النفايات </li></ul> أنابيب : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيليكون ، 3 مم الخارجي ، 1 مم الداخلية (أولي ديتش) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيليكون ، 4 القطر الخارجي ملم ، 2 ملم القطر الداخلي (OLE ديتش) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Marprene ، 3 مم الخارجي ، 1 مم الداخلية (واطسون ، مارلو) </li></ul> وسائل الاعلام <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> P. الزنجارية المتوسطة </td></tr><tr><td> A10 </td><td> ز / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 X 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> الأوتوكلاف </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 مل 1 م 2 CaCl </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 المعادن تتبع ميكرولتر / L (على الأغشية الحيوية ، P. الزنجارية) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> الأوتوكلاف </td></tr><tr><td colspan="2"> مزيج وFB A10 في نسبة 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> مصدر الكربون إضافة إلى التركيز المطلوب. </td></tr></tbody></table> <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> S. الجعوية الاصطناعية كاملة (SC) المتوسطة </td></tr><tr><td></td><td> ز / L </td></tr><tr><td> سلفات الأدينين </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - التربتوفان </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - هيستيدين - HCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - أرجينين - HCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - ميثيونين </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - التيروزين </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - يسين </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L - آيسولوسين </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L - يسين - HCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - فينيلالاناين </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - حمض الأسبارتيك </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L - حمض الغلوتاميك </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L - حمض أميني أساسي </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L - ثريونين </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L - سيرين </td><td> 0.40 </td></tr><tr><td> الخميرة الصأبةروجين قاعدة ث / س الأحماض الأمينية والأمونيا (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> كبريتات الامونيوم </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> حمض السكسينيك </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> الأوتوكلاف </td><td></td></tr><tr><td> الجلوكوز (تعقيمها بشكل منفصل) </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

العديد من الخلايا الجرثومية لديهم القدرة على تكوين المجتمعات الميكروبية لاطئة على النحو المحدد الأغشية الحيوية التي غيرت الخصائص الفيزيولوجية المرضية ومقارنة الكائنات الحية المجهرية الحرة. الأغشية الحيوية في الطبيعة وغالبا ما يصعب التحقيق فيها ويقيمون في ظل ظروف سيئة تعريف 1. باستخدام التحتية شفافة فمن الممكن أن الجهاز نظام حيث يمكن فحص بسيط الأغشية الحيوية بطريقة غير المدمرة في الوقت الحقيقي : نحن هنا لشرح تجميع وتشغيل نموذج نظام تدفق الخلية ، لفي الدراسات 3D المختبر من الأغشية الحيوية الميكروبية توليد استنساخ عالية في ظل ظروف محددة جيدا 2،3. ويتكون النظام من خلية تدفق التي هي بمثابة حجرة النمو للبيوفيلم. ويتم تزويد الخلية مع تدفق المواد الغذائية والأكسجين من قارورة المتوسطة عن طريق مضخة تمعجية والمتوسطة التي يتم جمعها في وعاء قضى النفايات. هذا البناء للنظام يسمح تدفق إمدادات مستمرة من المواد الغذائية والإدارة من المضادات الحيوية مثل اضطراب مع الحد الأدنى من الخلايا المزروعة في غرفة التدفق. وعلاوة على ذلك ، فإن ظروف تدفق داخل الخلية تدفق تسمح دراسات بيوفيلم تتعرض لإجهاد القص. فقاعة محاصرة فقاعات الهواء حدود الجهاز من الأنابيب التي على خلاف ذلك قد يعطل هيكل بيوفيلم في الخلية التدفق. نظام تدفق الخلية متوافق مع ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM) ، ويمكن بالتالي توفير المعلومات 3D مفصلة للغاية حول تطوير الأغشية الحيوية الميكروبية. ويمكن تسمية الخلايا في بيوفيلم مع تحقيقات أو البروتينات الفلورية متوافق مع تحليل CLSM. هذا التصور يمكن على الانترنت ويسمح التحقيق في محاريب في بيوفيلم النامية. الترابط الميكروبية ، والتحقيق في العوامل المضادة للجراثيم أو التعبير عن جينات محددة ، هي من الاجهزة التجريبية العديدة التي يمكن أن يتم التحقيق في تدفق نظام الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells at JoVE.com

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

بروتوكول يصف تطبيق نظام تدفق لزراعة الخلايا والأغشية الحيوية الميكروبية تحليل ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM).

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.5K Views.  Danish Technical University. بروتوكول يصف تطبيق نظام تدفق لزراعة الخلايا والأغشية الحيوية الميكروبية تحليل ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM).

Video: Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; استخدام ميني<em&gt; himar1</em&gt; مارينر الطفرات ينقول بوساطة

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

جيل من المتحولين في الإطار الجينات الحذف في الزائفة الزنجاريه واختبار لتوهين ضراوة في نموذج الماوس بسيطه من العدوى

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...