Name: pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
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1. Assemblea del Cell System flusso con tutti i componenti Il sistema a flusso assemblato comprende: tubi autoclavabile, trappole bolla, medio / scarto e celle di flusso, come mostrato nella Figura 1. Tutte queste parti possono essere riutilizzate tra esperimenti. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La cella di configurazione del flusso di sistema (componenti essenziali del setup). Il sistema di cella di flusso è composto da diversi componenti: una bottiglia di media, una pompa peristaltica, trappole bolla, la cella di flusso, una bottiglia di rifiuti, e diverse sezioni di tubi collegati tra loro da vari connettori. Figura gentilmente fornito da Rune Lyngklip. 2. Assemblea della cella di flusso <ol><li> La cella di flusso (Figura 2a) è trattata con corsie sottile di colla di silicone, con una siringa (Figura 3). </li><li> Inserire una copertura antiscivolo sulla parte superiore delle linee di silicone (Figura 3). Scivola copertura in vetro vengono utilizzati come substrato per P. aeruginosa, mentre scivola copertura in PVC vengono applicate per S. Saccharomyces biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema di cella a flusso e gorgogliatore 2. Descrizione dettagliata delle dimensioni utilizzate per la produzione di: a) flusso bolla trappola cellulare b), DTU Systems Biology. Ristampato con il permesso di John Wiley &amp; Sons, Inc. (DTU Systems Biology era precedentemente intitolato Biocentrum, come illustrato in figura) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Illustrazione delle linee di silicone applicazione della colla per il montaggio del substrato di vetro. Il vetro di copertura indicata è posizionato sopra la colla siliconica per fissarlo alla cella di flusso. <ol start="3"><li> Girare la cella di flusso e posizionarlo su una superficie piana con il lato antiscivolo coperchio verso il basso. Premere delicatamente sulla parte posteriore della cella di flusso per spingere la polizza di copertura sulla base della cella di flusso. Girare la cella di flusso più e per ispezionare le zone che non sono sigillate dal silicone. L&#39;(pistone) gestire parte di una siringa può essere utilizzato come uno strumento per premere delicatamente la cella di vetro e il flusso insieme. </li></ol> 3. Bottiglia di media <ol><li> Posizionare un tubo in silicone alimentare (2 mm di diametro interno) in una bottiglia di medie e inserire un connettore dritto all&#39;altra estremità. </li><li> Aggiungi medio della bottiglia (per il contenuto medio vedi paragrafo &quot;media&quot;) Coperchio del connettore e bottiglia con un foglio di metallo e autoclave del mezzo. Assicurarsi che l&#39;estremità del tubo di alimentazione è fisso al di sopra del livello del liquido nella bottiglia medio o un effetto sifone può svuotare la bottiglia di media quando autoclave. </li></ol> 4. Collegamento del gorgogliatore, cella di flusso e Pompa Montare tutti i tubi secondo lo schema in Figura 1. Utilizza tubi al silicone, tranne per la parte che passa attraverso la pompa peristaltica in cui viene applicato tubi Marprene. <ol><li> Al fine di collegare il tubo dalla bottiglia medio-tutte le camere flusso individuali, dividere un tubo nel numero di ingressi applicati durante l&#39;esperimento. Utilizzare connettori a T per rendere il numero auspicabile di tubi di collegamento dal tubo di alimentazione per i tubi Marprene nella pompa (vedi Figura 1, connettore a T). E &#39;generalmente una buona idea per mantenere lo stesso ordine sequenza di tubi e celle di flusso in tutto il sistema, per facilitare l&#39;identificazione dei componenti in caso di guasti nel sistema. </li><li> Collegare ogni singolo tubo di alimentazione (2 mm di diametro) a Marprene tubi nella pompa utilizzando connettori diritti. Collegare il tubo Marprene ad un gorgogliatore (Figura 2b) tramite un tubo in silicone intermedio (1 mm di diametro). Assicurarsi che la pompa è collegata all&#39;ingresso nella parte più alta del gorgogliatore. </li><li> Collegare il tubo di uscita risultante delle trappole bolla per l&#39;ingresso cella di flusso (1 mm di diametro), assicurarsi che la lunghezza di questi tubi permette la cella di flusso per essere trasferito alla fase del microscopio confocale (in genere 1 m). </li><li> Mettere 5 ml siringhe in cima alla trappole bolla. Chiudere la parte superiore con tappi idonei. </li><li> Sulla presa di cella di flusso collegare un breve, circa 40 pezzi mm (1 mm di diametro), tubi e utilizzare una &quot;riduzione&quot; connettore dritto per collegare un tubo di scarico (2 mm di diametro) della lunghezza necessaria. Posizionare i tubi dei rifiuti nel contenitore dei rifiuti. </li><li> È importante sottolineare che il contenitore dei rifiuti deve essere sempre posizionato allo stesso livello come le cellule di flusso, mai al di sotto del flusso delle cellule livello. Inoltre, assicurarsi che la fine del tubo di scarico è fissato al di sopra del livello previsto di rifiuti liquidi per evitare la filo-back a causa di un effetto sifone quando si maneggiano le celle di flusso. </li></ol> 5. STERILIZZAZIONE E LAVAGGIO DEL SISTEMA DI FLUSSO <ol><li> Togliere i tappi gorgogliatore e metterli in etanolo al 70% per tenerli sterili. </li><li> Marcia a velocità massima della pompa per riempire il sistema con il 0,5% (v / v) di ipoclorito di sodio in acqua. &lt;/ Li&gt; <li> Posizionare i tappi bolla trappola indietro quando la bolla trappole sono completamente riempiti. </li><li> Toccare il flusso di cellule per rimuovere le bolle nella camera di flusso. Fare attenzione a non danneggiare il vetro fragile coperchio. </li><li> Consentono al sistema di sterilizzare per 3-4 ore ad un flusso di 3 ml / h / canale (portata 0,2 mm / s lineare). </li><li> Lavare il sistema 2-3 volte a lavare tutte le ipoclorito. Riempire e svuotare l&#39;impianto con acqua sterile. Trappole bolla deve essere svuotato completamente tra ogni lavaggio. Questo può essere fatto mediante pompaggio in aria fino trappole bolla sono stati svuotati. Dopo lo svuotamento, togliere i tappi dalle trappole bolla prima di ricaricare il sistema. Rimettere i tappi dopo la bolla trappole sono state completamente riempita di liquido. Ripetere se necessario. </li><li> Esegui acqua sterile attraverso il sistema con un flusso basso (1-3 ml / h / canale) durante la notte o passare alla fase successiva. </li><li> Collegare la bombola di medie e di aspirazione e lavare il sistema con il mezzo durante la notte a bassa portata (3 ml / h / canale) alla temperatura in cui l&#39;esperimento verrà eseguito. Nota: le trappole bolla deve essere svuotato per l&#39;acqua prima che il sistema è pieno di media. </li></ol> 6. SEMINA DEL la cella di flusso <ol><li> Da un giorno all&#39;altro cultura fare una diluizione di una densità ottico desiderato (per esempio, P. aeruginosa 0,001 OD 600 nm e 0,1 OD 600nm per S. cerevisiae). </li><li> Utilizzare una siringa da 0,5 ml con un ago 27G per caricare inoculo sufficiente a riempire la camera. 250 microlitri è sufficiente per le camere di flusso che presentano le dimensioni specificate nel presente lavoro (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Fermare la pompa peristaltica. </li><li> Morsetto fuori il tubo di silicone che porta alla cella di flusso per impedire il riflusso nel sistema. </li><li> Sterilizzare l&#39;inoculazione sul tubo in silicone strofinandola con etanolo al 70%. </li><li> Inserire l&#39;ago nel tubo di silicone e introdurre la punta nella presa della cella di flusso. Iniettare lentamente l&#39;inoculo nella camera (attenzione a non iniettare bolle d&#39;aria). </li><li> Rimuovere l&#39;ago e pulire la sede di iniezione con etanolo al 70% seguita da immediata sigillatura del foro con colla siliconica sul sito di iniezione. </li><li> Capovolgere la cella a flusso e lasciare che i microrganismi aderiscono al substrato per 1 ora senza che il flusso attraverso la cella di flusso. </li><li> Girare la cella di flusso, avviare la pompa di media (3 ml / h / canale) e prendere la pinza dal tubo di silicone. </li><li> Il sistema è posto per l&#39;incubazione, a 37 ° C nel caso di P. aeruginosa e 30 ° C nel caso di S. cerevisiae. </li><li> Biofilm nelle camere a flusso possono ora essere visualizzati da CLSM. </li></ol> 7. COLORAZIONE di biofilm per la microscopia <ol><li> Fai una diluizione della colorazione appropriata (ad esempio 1:1000 Syto 9 vivere macchia di S. cerevisiae) </li><li> Fermare la pompa peristaltica. </li><li> Fascetta del tubo di silicone che porta alla cella a flusso. </li><li> Sterilizzare inoculazione sul tubo in silicone strofinandola con etanolo al 70%. </li><li> Utilizzare una siringa da 0,5 ml con un ago 27G per caricare soluzione abbastanza colorazione a riempire la camera. 250 microlitri è sufficiente per le camere flusso usato qui. </li><li> Inserire l&#39;ago nel tubo di silicone e introdurre la punta nella presa della cella di flusso. Iniettare lentamente la soluzione colorante nella camera (attenzione a non iniettare bolle). </li><li> Rimuovere l&#39;ago e pulire la sede di iniezione con etanolo al 70% seguita da sigillatura immediata del sito di iniezione. </li><li> Lasciare la cella di flusso senza flusso per 15 minuti. </li><li> Togliere il morsetto e avviare il flusso (3 ml / h / canale) </li><li> Acquisire dati con il CLSM </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo dimostrato un sistema a celle di flusso che rappresenta un potente strumento nelle indagini biofilm. In combinazione con immagini 3D con la microscopia confocale, il sistema ha una gamma di vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi dei biofilm microbici mediante tecniche microscopiche più tradizionali. Questo sistema permette la visualizzazione in 3D di comunità vive biofilm microbico senza disturbo della comunità. Microscopia ottica non fornirà informazioni dettagliate sulle nicchie del biofilm e, mentre la microscopia elettronica fornisce una risoluzione nanometrica del biofilm, non permette l&#39;imaging dal vivo delle cellule. Utilizzando il sistema descritto canale di flusso abbiamo già chiarito la distribuzione spaziale delle cellule batteriche sensibili ai diversi antibiotici 5-8 (Figura 4a), la distribuzione dei composti extracellulari, come ad esempio il DNA 9-11 e la distribuzione di cellule mobili e non mobili di la stessa specie all&#39;interno di una comunità batterica 4,6,9 (Figura 4c). Prevediamo che il sistema di cella di flusso possono essere utilizzati per studiare gli aspetti di biofilm lievito. Questa potrebbe essere la distribuzione spazio temporale dei biofilm lievito in risposta a fattori ambientali come fungicidi così come l&#39;identificazione di geni coinvolti nello sviluppo di lievito biofilm. Anche se il lievito non è noto a differenziarsi in cellule mobili e non mobili, altri aspetti di diversificazione biofilm possono essere studi come il cambiamento morfologico dal lievito alle cellule pseudohyphal e il passaggio da aploide a cellule diploidi. Abbiamo dimostrato un sistema che rispettano diverse specie microbiche e lavorerà con tecniche di colorazione diverse. Una varietà di sonde di colorazione diversa e proteine ​​fluorescenti, come GFP, consentono indagini specifica nicchia nel biofilm di sviluppo ed è uno strumento efficace per analizzare l&#39;effetto degli agenti antimicrobici o di altri fattori ambientali. Le informazioni che si possono ottenere è molto dettagliata (Figura 4) e le caratteristiche nel biofilm può essere quantificato con programmi per computer come COMSTAT 12,13. Nel complesso, l&#39;aspetto più critico del protocollo è il fatto che si tratta di un processo che richiede tempo. E &#39;anche una limitazione che le cellule devono essere in grado di crescere in modo non fluorescente, superficie trasparente. . Dato che il biofilm formato viene analizzato con un microscopio confocale, la profondità che può essere indagato è limitata a qualche centinaio di micrometri 14 Ci sono ulteriori limitazioni tecniche inerenti alla progettazione: il sistema non è adatto per screening ad alto rendimento, come un ricercatore esperto in grado di gestire al massimo circa 15 canali per esperimento, che a sua volta può richiedere diversi giorni per prepararsi. Tuttavia, gli antibiotici o mutanti che sono considerati rilevanti per gli studi di biofilm può inizialmente essere messa a screening con altri metodi come macchie di cristallo viola prima che i candidati più interessanti sono trasferite al sistema di cella di flusso. Le lamiere di copertura in vetro sono molto sottili e si rompono facilmente, e si deve prestare attenzione durante la manipolazione del sistema. Inoltre i tubi dovrebbero essere esaminati ogni giorno durante la corsa di un esperimento, come una notevole &quot;back-crescita&quot; nei tubi di aspirazione a monte delle cellule flusso può verificarsi. Tale contaminazione può essere risolto rimuovendo diversi centimetri di tubo di silicone dal lato ingresso delle cellule di flusso, con tecnica sterile. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 a) quattro giorni PAO1 vecchia -. Biofilm GFP trattati per 24 ore con colistina e ioduro di propidio per la colorazione morti (macchia rossa) b) presentazione in 3D di una tre giorni di vecchio P. PAO1 aeruginosa (P. aeruginosa tipo selvatico) - GFP biofilm 6 c) immagine di presentazione in 3D di un PAO1 - CFP pila mutante (blu) con un tipo di PAO1 YFP selvatico (giallo), d) 5 giorno di vita PAO1 - GFP biofilm presentato come un 3D e immagine) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante in CEN.PK sfondo) biofilm colorate con Syto-9 15.

<ul><li> Trappole Bubble, polietilene (DTU Systems Biology, Università Tecnica di Danimarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm 20Setup.aspx%%) </li><li> Connettori in plastica trasparente in polipropilene e T-connettori (Cole Parmer, 1 / 8 pollici (3,175 mm) e 1 / 16 pollici (1.588 mm)) </li><li> Morsetti </li><li> Microscopio confocale (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Coprioggetto, vetro (Knittel Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Coprioggetto, PVC coprioggetti (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Celle di flusso, il polietilene (DTU Systems Biology, Università Tecnica di Danimarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm 20Setup.aspx%% </li><li> Bottiglie Media (Schott) </li><li> Pompa peristaltica (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rotolamento carrello per i sistemi di flusso e pompe </li><li> Silicone colla (3M Super Sigillante siliconico trasparente) </li><li> Siringa da 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml siringhe con aghi (27G, Terumo LU-100) </li><li> Contenitore dei rifiuti </li></ul> Tubi: <ul><li> Silicone, 3 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno (Ole Dich) </li><li> Silicone, 4 mm di diametro esterno, 2 mm diametro interno (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno (Watson-Marlow) </li></ul> Media <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa media </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 ml di 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 l / L metalli in tracce (per P. aeruginosa-biofilm) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare A10 e FB in un rapporto di 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere la sorgente di carbonio ad una concentrazione desiderata. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae sintetico completo (SC) di media </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Solfato di adenina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-istidina-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-arginina-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-lisina HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-acido aspartico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> Acido L-glutammico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Lievito NitRogen Base w / o aminoacidi e di ammonio (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Solfato di ammonio </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Acido succinico </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio (autoclavato a parte) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

Cellule microbiche Molti hanno la capacità di formare comunità microbiche sessili definito come biofilm che hanno modificato le proprietà fisiologiche e patologiche rispetto ai microrganismi che vivono liberi. Biofilm in natura sono spesso difficili da indagare e di soggiornare in condizioni di scarsa definite 1. Utilizzando un substrato trasparente è possibile al dispositivo di un sistema in cui biofilm semplici possono essere esaminate in maniera non distruttiva in tempo reale: qui dimostriamo il montaggio e il funzionamento di un sistema di modello di flusso di cellule, per studi in vitro 3D dei biofilm microbici generando alta riproducibilità sotto ben definite condizioni di 2,3. Il sistema è costituito da una cella di flusso che funge da camera di crescita per il biofilm. La cella di flusso è fornito con sostanze nutritive e ossigeno da una fiaschetta di media tramite una pompa peristaltica e medio speso è raccolto in un contenitore dei rifiuti. Questa costruzione del sistema di flusso consente un approvvigionamento continuo di sostanze nutritive e la somministrazione di antibiotici ad esempio, con il minimo disturbo delle cellule coltivate in camera di flusso. Inoltre, le condizioni di flusso all&#39;interno della cella di flusso consentono studi di biofilm esposti a sollecitazioni di taglio. Una bolla cattura confini dispositivo di bolle d&#39;aria dal tubo che altrimenti potrebbe disturbare la struttura di biofilm nella cella di flusso. Il sistema di cella di flusso è compatibile con microscopio confocale a scansione laser (CLSM) e può quindi fornire informazioni molto dettagliate 3D sullo sviluppo biofilm microbici. Cellule del biofilm possono essere etichettati con sonde fluorescenti o proteine ​​compatibile con l&#39;analisi CLSM. Ciò consente la visualizzazione on-line e permette di indagine di nicchie nel biofilm via di sviluppo. Interrelazione microbica, indagine degli agenti antimicrobici o l&#39;espressione di specifici geni, sono delle configurazioni molti sperimentale che può essere indagato nel sistema di cella di flusso.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocollo che descrive l&#39;applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l&#39;analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.7K Views.  Danish Technical University. Protocollo che descrive l'applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l'analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

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Immunologia e infezioni

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

L&#39;uso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Bioingegneria

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

Live Cell analisi della sollecitazione di taglio su Pseudomonas aeruginosa utilizzando un sistema di microfluidica superiore-Throughput automatizzato

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modello CF adattabile per test antimicrobici e analisi della dinamica microbica

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Sviluppo di un modello di biofilm di colonia polimicrobica per testare gli antimicrobici nella fibrosi cistica

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

Sviluppo di un modello di biofilm di colonia polimicrobica per testare gli antimicrobici nella fibrosi cistica

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...