Name: pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
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1。すべてのコンポーネントとフローセルシステムの組立組み立てたフローシステムが含まれています：図1に示すように、オートクレーブ可能なチューブ、バブルトラップ、ミディアム/廃棄​​物ボトルとフローセルを。これらすべての部分は実験間で再利用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="図1" /> 図1のフローセルシステムのセットアップ（セットアップの基本的なコンポーネント）。培地ボトル、蠕動ポンプ、バブルトラップ、フローセル、廃液ボトル、および各種コネクタによって相互接続されたチューブの様々なセクション：フローセルシステムは、いくつかのコンポーネントで構成されています。親切にルーンLyngklipで提供される図。 2。フローセルの組み立て<ol><li>フローセル（図2a）は、注射器（図3）を使用して、シリコンの接着剤の薄い車線で扱われます。 </li><li>シリコンライン（図3）の上にカバースリップを置きます。ガラスカバースリップは、Pの基層として使用されていますPVCカバースリップがSで適用されている間緑膿菌出芽酵母のバイオフィルム。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。フローセルと気泡のトラップ2の模式図。 ）フローセルB）バブルトラップ、DTUシステム生物学の生産に使用されるディメンションの詳細な説明。ジョンワイリー＆サンズ社（DTUシステムバイオロジーは、以前のような図に示すように、Biocentrum題された）の許可を得て転載<img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ガラス基質の結合のためのシリコーンの接着剤のアプリケーションの線のイラスト。指定されたカバーガラスは、フローセルに取り付けるためのシリコーンの接着剤を介して配置されます。 <ol start="3"><li>フローセルを裏返しにして、側を下にスリップカバーを平らな面に置きます。フローセルのベース上にカバースリップをプッシュするフローセルの後ろを軽く押してください。フローセルを裏返しにして、シリコンで密封されていない領域に対して検査します。注射器のハンドル（ピストン）の部分を穏やかに一緒にガラスとフローセルを押すためのツールと​​して使用することができます。 </li></ol> 3。培地ボトル<ol><li>培地ボトルで供給シリコンチューブ（2内径）を配置し、もう一方の端に直線コネクタを挿入します。 </li><li>瓶に培地を加え（培地のコンテンツを&quot;メディア&quot;の段落を参照） 金属箔付きコネクタとボトルをカバーし、培地をオートクレーブ。高圧蒸気滅菌時に培地ボトルやサイホン効果で液面が培地ボトルを空にすることが、上記供給管の端が固定されていることを確認します。 </li></ol> 4。バブルトラップ、フローセルとポンプを接続する図1のアウトラインに従って、すべてのチューブを組み立てます。 Marpreneチューブが適用される蠕動ポンプを通過する部分を除いてシリコンチューブを使用してください。 <ol><li>すべての個々のフローチャンバーへの培地ボトルからチューブを接続するために、実験に適用される入り江の必要数にチューブを分割する。フィードチューブからポンプでMarpreneチューブに接続管の望ましい数を作るためにT -コネクタを使用します（図1、T -コネクタを参照）。それはシステムの故障の場合にはコンポーネントの識別を容易にするために、一般的にシステム全体の管とフローセルの同じシーケンスの順序を維持することをお勧めします。 </li><li>ストレートコネクタを使用してポンプにチューブをMarpreneする個々の栄養チューブ（直径2 mm）を接続します。中間のシリコンチューブ（直径1mm）を経由して泡のトラップ（図2b）にMarpreneチューブを接続します。ポンプが気泡トラップの一番高い部分でのインレットに接続されていることを確認します。 </li><li>フローセルのインレット（直径1mm）にバブルトラップの結果として排出管を接続し、これらのチューブの長さは、フローセルを共焦点顕微鏡（通常は1メートル）のステージに移動することを可能にすることを確認してください。 </li><li>バブルトラップの上に場所5 mLシリンジ。適当なキャップでトップを閉じます。 </li><li>フローセルの出口での短い、約40 mmの片（直径1mm）、チューブを接続し、必要な長さの廃液チューブ（直径2 mm）を添付する&quot;還元&quot;ストレートコネクタを使用してください。廃棄物コンテナに廃棄物のチューブを置きます。 </li><li>重要なことは、廃棄物の容器は常に決してフローセルレベルの下で、フローセルと同じレベルに配置する必要があります。また、廃液チューブの端がフローセルを取り扱う際サイフォン効果によるフラッシュバックを避けるために廃液の期待されるレベルより上に固定されていることを確認します。 </li></ol> 5。フローシステムを殺菌、洗濯<ol><li>バブルトラップのキャップを取り外し、それらを無菌に保つために70％エタノールの中に置いてください。 </li><li> 0.5％（v / v）の水に次亜塩素酸ナトリウムを使用してシステムを埋めるために最高のポンプの速度で動作します。&lt;/ LI&gt; <li>バックバブルトラップが完全に埋められたときにバブルトラップのキャップを置きます。 </li><li>フローチャンバーに気泡を除去するために、フローセルをタップします。壊れやすいカバーガラスを傷つけないように注意してください。 </li><li>システムは、3 mLの/ H /チャネル（0.2 mm / sの線流速）の流量で3〜4時間のために殺菌することができます。 </li><li>システムのすべての次亜塩素酸塩を洗い流すために2〜3回洗浄する。滅菌水を使用してシステムを記入し、空にしてください。バブルトラップは、それぞれの洗浄の間に完全に空にする必要があります。これは、バブルトラップが空にされるまで、空気でポンピングすることによって行うことができます。空にした後、システムを再充填する前にバブルトラップからキャップを取り外します。バブルトラップが完全に液体で満たされた後キャップを交換してください。必要に応じて繰り返します。 </li><li>一晩の低流量（1-3 mLの/ H /チャンネル）でシステムを介して滅菌水を実行したり、次のステップに進みます。 </li><li>入口に培地ボトルを接続し、実験が行われる温度で、低流量（3 mLの/ H /チャネル）で一晩培地を使用してシステムをフラッシュします。注：システムは、媒体が充填される前に、バブルトラップが水のために空にする必要があります。 </li></ol> 6。フローセルの接種<ol><li>一晩培養液から所望の光学濃度（ 緑膿菌などは0.001 OD 600nmの 、0.1 OD 600nmの S.セレビシエのため）に希釈を行う。 </li><li>チャンバーを満たすのに十分な接種をロードするために27G針を0.5mLの注射器を使用してください。 250μL（図2。、× 4㎜× 1ミリメートル40ミリメートル）この作業で指定された寸法を有するフローチャンバーには十分です。 </li><li>蠕動ポンプを停止します。 </li><li>システムへの逆流を防ぐためにフローセルにつながるシリコンチューブをオフにクランプ。 </li><li> 70％エタノールでそれを拭いてシリコンチューブで接種部位を滅菌する。 </li><li>シリコンチューブに針を挿入し、フローセルの入口に先端を導入する。ゆっくり（気泡を注入しないように注意してください）​​チャンバー内に接種を注入する。 </li><li>針を外し、注射部位を介してシリコン接着剤を使用して穴の直接のシールに続いて70％エタノールで注射部位を拭きます。 </li><li>フローセルを裏返しにして、微生物がフローセルをフローすることなく1時間基層に付着することができます。 </li><li> 、フローセルを回し培地ポンプ（3 mLの/ H /チャンネル）を起動して、シリコンチューブからクランプを取る。 </li><li>システムは37℃、インキュベーションのために配置され° CをPの場合には緑膿菌と30 ° Sの場合のC 出芽酵母 。 </li><li>フローチャンバー内のバイオフィルムは、現在、CLSM可視化することができる。 </li></ol> 7。顕微鏡用バイオフィルムの染色<ol><li>適切な染色の希釈を行う（例えば1:1000 SYTO 9は、S.セレビシエのために染色生きる） </li><li>蠕動ポンプを停止します。 </li><li>フローセルにつながるシリコンチューブをクランプする。 </li><li> 70％エタノールでそれを拭いてシリコンチューブで接種部位を滅菌する。 </li><li>室を埋めるのに十分な染色液をロードするために27G針を0.5mLの注射器を使用してください。 250μLはここで使用されるフ​​ローチャンバーには十分です。 </li><li>シリコンチューブに針を挿入し、フローセルの入口に先端を導入する。ゆっくり（気泡を注入しないように注意してください）​​チャンバー内に染色液を注入する。 </li><li>針を外し、注射部位の直接のシールに続いて70％エタノールで注射部位を拭きます。 </li><li> 15分間流すことなくフローセルにしておきます。 </li><li>クランプを外し、（3 mLの/ H /チャンネル）フローを開始</li><li> CLSMでデータを取得する</li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li><li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li><li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、バイオフィルムの調査の強力なツールを表すフロー電池システムを実証している。共焦点顕微鏡による3Dイメージングとの組み合わせにより、システムはより伝統的な顕微鏡技術を用いて微生物のバイオフィルムを分析する他の方法と比較して優位性の範囲を持っています。このシステムは、地域の障害なく微生物のバイオフィルムのコミュニティの生活の3D可視化することができます。光学顕微鏡は、バイオフィルムのニッチについての詳細な情報を提供することはありませんし、電子顕微鏡は、バイオフィルムのナノスケールの分解能を提供しますが、それは、生細胞イメージングを許可しません。 、我々は以前にいくつかの抗生物質5-8（図4a）、細胞外化合物の分布に敏感な細菌細胞の空間的分布を解明している説明に従って流路システムを用いたDNA 9月11日などと、の運動性と非運動性細胞の分布細菌群集4,6,9（図4c）内で同じ種。我々は、フローセルシステムは、酵母のバイオフィルムの側面を研究するために使用できることを想像する。これは、殺菌剤だけでなく、酵母のバイオフィルム形成に関与する遺伝子の同定などの環境要因に応答して、酵母のバイオフィルムの時空間的な分布になることがあります。酵母は、運動性と非運動性の細胞に分化することが知られていないものの、バイオフィルムの多様化の他の側面は、そのような酵母から偽菌糸細胞に形態学的変化と一倍から二倍体細胞へのシフトなどの研究があります。 我々は、いくつかの微生物種を遵守し、いくつかの染色技術で動作するシステムを示している。異なる染色プローブやGFPなどの蛍光タンパク質、様々な、発展途上バイオフィルム内の特定のニッチの調査を有効にして、抗菌剤または他の環境要因の影響を分析する効果的なツールです。得ることができる情報は非常に詳しいです（図4）とバイオフィルムの特徴は、犯罪統計システム12,13のようなコンピュータプログラムを使用して定量することができる。 全体的に、プロトコルの最も重要な側面は、それは時間のかかるプロセスであるという事実である。また、細胞は非蛍光、透明な表面上に成長できるようにするために必要な制限です。このシステムは、経験豊富な研究者として、ハイスループットスクリーニングに適していない。形成されたバイオフィルムは、共焦点顕微鏡、数百ミクロン14に制限されて調査することができる深さを用いて分析されるので、設計に内在するさらなる技術的な制限があります。順番に準備するために数日かかることが実験で、あたりのほとんどの約15チャンネルで扱うことができます。最も興味深いの候補者がフローセルシステムに転送される前に、しかし、バイオフィルムの研究のために適切と見なされている抗生物質や変異体は、当初の質量などのクリスタルバイオレット染色など他の方法でスクリーニングすることができる。カバーガラスのシートは非常に細く、壊れやすい、とシステムを取り扱う際は注意が必要です。さらに、チューブは、実験の実行中に毎日検査されるべきである。フローセルのすぐ上流インレットチューブでかなりの&quot;バック成長&quot;としては、発生する可能性があります。そのような汚染は、無菌操作を使用して、フローセルの入口側からシリコンチューブの数センチを削除すれば解決することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="図4" /> 図4）4日目のPAO1 - 。死んだ染色（赤色染色）b）の三日間の3Dプレゼンテーション古いP.用コリスチンおよびヨウ化プロピジウムで24時間の治療を受けてGFPのバイオフィルム緑膿菌 PAO1（ 緑膿菌野生型） - GFPバイオフィルムC 6）PAO1の3D画像のプレゼンテーション- PAO1野生型YFP（黄色）DとCFP pilumの複数形変異体（青））5日齢のPAO1 - GFPバイオフィルムは3Dとして提示画像E）26時間S.出芽酵母 （CEN.PKのバックグラウンドでPTR3変異体）SYTO - 9 15で染色したバイオフィルム。

<ul><li>バブルトラップ、ポリエチレン（DTUシステム生物学、デンマーク工科大学、％の20Center/Resources/Biofilm％の20Setup.aspxをhttp://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument） </li><li>透明なポリプロピレンのプラスチックコネクタとT -コネクタ（コールパーマー、1 / 8インチ（3.175ミリメートル）と1 / 16インチ（1.588ミリメートル）） </li><li>クランプ</li><li>共焦点顕微鏡（Zeiss、メタLSM510） </li><li>カバーグラス、ガラス（クニッテルグレイザー）50 × 24ミリメートル</li><li>カバーガラス、PVCカバースリップ（Rinzl）50 × 24ミリメートル</li><li>フローセル、ポリエチレン（DTUシステム生物学、デンマーク工科大学、％の20Center/Resources/Biofilm％の20Setup.aspxをhttp://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument </li><li>培地ボトル（ショット） </li><li>ペリスタルティックポンプ（ワトソン - マーロウ、205S） </li><li>フローシステムやポンプ用のローリングカート</li><li>シリコン接着剤（3Mスーパーシリコーンシーラントクリア） </li><li>シリンジ5mLの（テルモ） </li><li> SYTO 9（Molecular Probes社） </li><li>針（27G、テルモLU - 100）0.5 mLシリンジ</li><li>廃棄物コンテナ</li></ul>チューブ： <ul><li>シリコンは3ミリメートル、外径は、1mm内径（オレDich） </li><li>シリコンの4 mm、外径は2mm内径（オレDich） </li><li> Marpreneは3ミリメートル、外径は、1mm内径（ワトソン - マーロウ） </li></ul>メディアの<table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 緑膿菌の培地 </td></tr><tr><td> A10 </td><td> G / L </td></tr><tr><td> （NH 4）2 SO 4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 3.0 </td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 mLの1 M CaCl 2を </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100μL/ L微量金属（ 緑膿菌 -バイオフィルム用）4 </td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ</td></tr><tr><td colspan="2"> 1:10の比率でA10とFBを混ぜる。 </td></tr><tr><td colspan="2">所望の濃度に炭素源を追加。 </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiaeの合成完全（SC）培地 </td></tr><tr><td></td><td> G / L </td></tr><tr><td>硫酸アデニン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -トリプトファン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -ヒスチジンHCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -アルギニンHCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L -メチオニン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -チロシン</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -ロイシン</td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L -イソロイシン</td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L -リジンHCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -フェニルアラニン</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -アスパラギン酸</td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L -グルタミン酸</td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L -バリン</td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L -トレオニン</td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L -セリン</td><td> 0.40 </td></tr><tr><td>酵母NITロゲンベースW / Oアミノ酸とアンモニウム（バクト） </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> 6.0 </td></tr><tr><td>コハク酸</td><td> 10.0 </td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td></tr><tr><td>グルコース（別々にオートクレーブ処理） </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

多くの微生物細胞は自由生活微生物に比べて生理学的および病理学的特性を変更したバイオフィルムのように定義されて付着微生物群集を形成する能力を持っている。自然の中でバイオフィルムは、しばしば不十分な定義された条件1の下で調査し、存在することは困難です。透明な基層を使用して、それはデバイスへの簡単なバイオフィルムをリアルタイムに非破壊的方法で調べることのできるシステムが可能です：ここでは、微生物バイオフィルムの in vitro 3D での研究のために、フローセルのモデルシステムの組み立てと動作を実証明確に定義された条件2,3の下で高い再現性を生成する。 システムは、バイオフィルムの成長チャンバーとして機能するフローセルで構成されています。フローセルは、蠕動ポンプを介して培地フラスコから栄養と酸素を供給され、使用済み培地は、廃棄物の容器に集めている。フローシステムのこの構造は、フローチャンバーで培養した細胞の軽微な障害を持つ栄養素と例えば抗生物質の投与を継続的に供給することができます。また、フローセル内の流れの条件は、せん断応力にさらされるバイオフィルムの研究を可能にする。そうでない場合はフローセル内のバイオフィルムの構造を破壊することができるチューブからデバイスの範囲の気泡をトラップする泡。 フローセルシステムでは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）と互換性があり、それによって微生物のバイオフィルムの開発についての非常に詳細な3D情報を提供することができます。バイオフィルム中の細胞を蛍光プローブまたはCLSM分析と互換性のあるタンパク質で標識することができます。これはオンラインで可視化を可能にし、開発するバイオフィルムのニッチの調査を可能にします。微生物の相互関係、抗菌剤の調査や特定の遺伝子の発現は、フローセルシステムで調べることができる多くの実験装置のものである。

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.7K ビュー.  Danish Technical University. プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

免疫・感染学

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

生物工学

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

PCRプレートディープウェルマイクロプレートデバイスを用いた細菌バイオフィルムバイオマスの生成

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>抗菌試験および微生物動態解析のための適応型CFモデル

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

要約

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共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

緑膿菌自動の高スループットマイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

リアルタイムイメージングと二相循環フローシステムを用いた菌バイオフィルム開発の定量

PCRプレートディープウェルマイクロプレートデバイスを用いた細菌バイオフィルムバイオマスの生成

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

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共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

PCRプレートディープウェルマイクロプレートデバイスを用いた細菌バイオフィルムバイオマスの生成

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

緑膿菌自動の高スループットマイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

リアルタイムイメージングと二相循環フローシステムを用いた菌バイオフィルム開発の定量