1。すべてのコンポーネントとフローセルシステムの組立組み立てたフローシステムが含まれています：図1に示すように、オートクレーブ可能なチューブ、バブルトラップ、ミディアム/廃棄​​物ボトルとフローセルを。これらすべての部分は実験間で再利用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="図1" /> 図1のフローセルシステムのセットアップ（セットアップの基本的なコンポーネント）。培地ボトル、蠕動ポンプ、バブルトラップ、フローセル、廃液ボトル、および各種コネクタによって相互接続されたチューブの様々なセクション：フローセルシステムは、いくつかのコンポーネントで構成されています。親切にルーンLyngklipで提供される図。 2。フローセルの組み立て<ol><li>フローセル（図2a）は、注射器（図3）を使用して、シリコンの接着剤の薄い車線で扱われます。 </li><li>シリコンライン（図3）の上にカバースリップを置きます。ガラスカバースリップは、Pの基層として使用されていますPVCカバースリップがSで適用されている間緑膿菌出芽酵母のバイオフィルム。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。フローセルと気泡のトラップ2の模式図。 ）フローセルB）バブルトラップ、DTUシステム生物学の生産に使用されるディメンションの詳細な説明。ジョンワイリー＆サンズ社（DTUシステムバイオロジーは、以前のような図に示すように、Biocentrum題された）の許可を得て転載<img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ガラス基質の結合のためのシリコーンの接着剤のアプリケーションの線のイラスト。指定されたカバーガラスは、フローセルに取り付けるためのシリコーンの接着剤を介して配置されます。 <ol start="3"><li>フローセルを裏返しにして、側を下にスリップカバーを平らな面に置きます。フローセルのベース上にカバースリップをプッシュするフローセルの後ろを軽く押してください。フローセルを裏返しにして、シリコンで密封されていない領域に対して検査します。注射器のハンドル（ピストン）の部分を穏やかに一緒にガラスとフローセルを押すためのツールと​​して使用することができます。 </li></ol> 3。培地ボトル<ol><li>培地ボトルで供給シリコンチューブ（2内径）を配置し、もう一方の端に直線コネクタを挿入します。 </li><li>瓶に培地を加え（培地のコンテンツを&quot;メディア&quot;の段落を参照） 金属箔付きコネクタとボトルをカバーし、培地をオートクレーブ。高圧蒸気滅菌時に培地ボトルやサイホン効果で液面が培地ボトルを空にすることが、上記供給管の端が固定されていることを確認します。 </li></ol> 4。バブルトラップ、フローセルとポンプを接続する図1のアウトラインに従って、すべてのチューブを組み立てます。 Marpreneチューブが適用される蠕動ポンプを通過する部分を除いてシリコンチューブを使用してください。 <ol><li>すべての個々のフローチャンバーへの培地ボトルからチューブを接続するために、実験に適用される入り江の必要数にチューブを分割する。フィードチューブからポンプでMarpreneチューブに接続管の望ましい数を作るためにT -コネクタを使用します（図1、T -コネクタを参照）。それはシステムの故障の場合にはコンポーネントの識別を容易にするために、一般的にシステム全体の管とフローセルの同じシーケンスの順序を維持することをお勧めします。 </li><li>ストレートコネクタを使用してポンプにチューブをMarpreneする個々の栄養チューブ（直径2 mm）を接続します。中間のシリコンチューブ（直径1mm）を経由して泡のトラップ（図2b）にMarpreneチューブを接続します。ポンプが気泡トラップの一番高い部分でのインレットに接続されていることを確認します。 </li><li>フローセルのインレット（直径1mm）にバブルトラップの結果として排出管を接続し、これらのチューブの長さは、フローセルを共焦点顕微鏡（通常は1メートル）のステージに移動することを可能にすることを確認してください。 </li><li>バブルトラップの上に場所5 mLシリンジ。適当なキャップでトップを閉じます。 </li><li>フローセルの出口での短い、約40 mmの片（直径1mm）、チューブを接続し、必要な長さの廃液チューブ（直径2 mm）を添付する&quot;還元&quot;ストレートコネクタを使用してください。廃棄物コンテナに廃棄物のチューブを置きます。 </li><li>重要なことは、廃棄物の容器は常に決してフローセルレベルの下で、フローセルと同じレベルに配置する必要があります。また、廃液チューブの端がフローセルを取り扱う際サイフォン効果によるフラッシュバックを避けるために廃液の期待されるレベルより上に固定されていることを確認します。 </li></ol> 5。フローシステムを殺菌、洗濯<ol><li>バブルトラップのキャップを取り外し、それらを無菌に保つために70％エタノールの中に置いてください。 </li><li> 0.5％（v / v）の水に次亜塩素酸ナトリウムを使用してシステムを埋めるために最高のポンプの速度で動作します。&lt;/ LI&gt; <li>バックバブルトラップが完全に埋められたときにバブルトラップのキャップを置きます。 </li><li>フローチャンバーに気泡を除去するために、フローセルをタップします。壊れやすいカバーガラスを傷つけないように注意してください。 </li><li>システムは、3 mLの/ H /チャネル（0.2 mm / sの線流速）の流量で3〜4時間のために殺菌することができます。 </li><li>システムのすべての次亜塩素酸塩を洗い流すために2〜3回洗浄する。滅菌水を使用してシステムを記入し、空にしてください。バブルトラップは、それぞれの洗浄の間に完全に空にする必要があります。これは、バブルトラップが空にされるまで、空気でポンピングすることによって行うことができます。空にした後、システムを再充填する前にバブルトラップからキャップを取り外します。バブルトラップが完全に液体で満たされた後キャップを交換してください。必要に応じて繰り返します。 </li><li>一晩の低流量（1-3 mLの/ H /チャンネル）でシステムを介して滅菌水を実行したり、次のステップに進みます。 </li><li>入口に培地ボトルを接続し、実験が行われる温度で、低流量（3 mLの/ H /チャネル）で一晩培地を使用してシステムをフラッシュします。注：システムは、媒体が充填される前に、バブルトラップが水のために空にする必要があります。 </li></ol> 6。フローセルの接種<ol><li>一晩培養液から所望の光学濃度（ 緑膿菌などは0.001 OD 600nmの 、0.1 OD 600nmの S.セレビシエのため）に希釈を行う。 </li><li>チャンバーを満たすのに十分な接種をロードするために27G針を0.5mLの注射器を使用してください。 250μL（図2。、× 4㎜× 1ミリメートル40ミリメートル）この作業で指定された寸法を有するフローチャンバーには十分です。 </li><li>蠕動ポンプを停止します。 </li><li>システムへの逆流を防ぐためにフローセルにつながるシリコンチューブをオフにクランプ。 </li><li> 70％エタノールでそれを拭いてシリコンチューブで接種部位を滅菌する。 </li><li>シリコンチューブに針を挿入し、フローセルの入口に先端を導入する。ゆっくり（気泡を注入しないように注意してください）​​チャンバー内に接種を注入する。 </li><li>針を外し、注射部位を介してシリコン接着剤を使用して穴の直接のシールに続いて70％エタノールで注射部位を拭きます。 </li><li>フローセルを裏返しにして、微生物がフローセルをフローすることなく1時間基層に付着することができます。 </li><li> 、フローセルを回し培地ポンプ（3 mLの/ H /チャンネル）を起動して、シリコンチューブからクランプを取る。 </li><li>システムは37℃、インキュベーションのために配置され° CをPの場合には緑膿菌と30 ° Sの場合のC 出芽酵母 。 </li><li>フローチャンバー内のバイオフィルムは、現在、CLSM可視化することができる。 </li></ol> 7。顕微鏡用バイオフィルムの染色<ol><li>適切な染色の希釈を行う（例えば1:1000 SYTO 9は、S.セレビシエのために染色生きる） </li><li>蠕動ポンプを停止します。 </li><li>フローセルにつながるシリコンチューブをクランプする。 </li><li> 70％エタノールでそれを拭いてシリコンチューブで接種部位を滅菌する。 </li><li>室を埋めるのに十分な染色液をロードするために27G針を0.5mLの注射器を使用してください。 250μLはここで使用されるフ​​ローチャンバーには十分です。 </li><li>シリコンチューブに針を挿入し、フローセルの入口に先端を導入する。ゆっくり（気泡を注入しないように注意してください）​​チャンバー内に染色液を注入する。 </li><li>針を外し、注射部位の直接のシールに続いて70％エタノールで注射部位を拭きます。 </li><li> 15分間流すことなくフローセルにしておきます。 </li><li>クランプを外し、（3 mLの/ H /チャンネル）フローを開始</li><li> CLSMでデータを取得する</li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. 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K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、バイオフィルムの調査の強力なツールを表すフロー電池システムを実証している。共焦点顕微鏡による3Dイメージングとの組み合わせにより、システムはより伝統的な顕微鏡技術を用いて微生物のバイオフィルムを分析する他の方法と比較して優位性の範囲を持っています。このシステムは、地域の障害なく微生物のバイオフィルムのコミュニティの生活の3D可視化することができます。光学顕微鏡は、バイオフィルムのニッチについての詳細な情報を提供することはありませんし、電子顕微鏡は、バイオフィルムのナノスケールの分解能を提供しますが、それは、生細胞イメージングを許可しません。 、我々は以前にいくつかの抗生物質5-8（図4a）、細胞外化合物の分布に敏感な細菌細胞の空間的分布を解明している説明に従って流路システムを用いたDNA 9月11日などと、の運動性と非運動性細胞の分布細菌群集4,6,9（図4c）内で同じ種。我々は、フローセルシステムは、酵母のバイオフィルムの側面を研究するために使用できることを想像する。これは、殺菌剤だけでなく、酵母のバイオフィルム形成に関与する遺伝子の同定などの環境要因に応答して、酵母のバイオフィルムの時空間的な分布になることがあります。酵母は、運動性と非運動性の細胞に分化することが知られていないものの、バイオフィルムの多様化の他の側面は、そのような酵母から偽菌糸細胞に形態学的変化と一倍から二倍体細胞へのシフトなどの研究があります。 我々は、いくつかの微生物種を遵守し、いくつかの染色技術で動作するシステムを示している。異なる染色プローブやGFPなどの蛍光タンパク質、様々な、発展途上バイオフィルム内の特定のニッチの調査を有効にして、抗菌剤または他の環境要因の影響を分析する効果的なツールです。得ることができる情報は非常に詳しいです（図4）とバイオフィルムの特徴は、犯罪統計システム12,13のようなコンピュータプログラムを使用して定量することができる。 全体的に、プロトコルの最も重要な側面は、それは時間のかかるプロセスであるという事実である。また、細胞は非蛍光、透明な表面上に成長できるようにするために必要な制限です。このシステムは、経験豊富な研究者として、ハイスループットスクリーニングに適していない。形成されたバイオフィルムは、共焦点顕微鏡、数百ミクロン14に制限されて調査することができる深さを用いて分析されるので、設計に内在するさらなる技術的な制限があります。順番に準備するために数日かかることが実験で、あたりのほとんどの約15チャンネルで扱うことができます。最も興味深いの候補者がフローセルシステムに転送される前に、しかし、バイオフィルムの研究のために適切と見なされている抗生物質や変異体は、当初の質量などのクリスタルバイオレット染色など他の方法でスクリーニングすることができる。カバーガラスのシートは非常に細く、壊れやすい、とシステムを取り扱う際は注意が必要です。さらに、チューブは、実験の実行中に毎日検査されるべきである。フローセルのすぐ上流インレットチューブでかなりの&quot;バック成長&quot;としては、発生する可能性があります。そのような汚染は、無菌操作を使用して、フローセルの入口側からシリコンチューブの数センチを削除すれば解決することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="図4" /> 図4）4日目のPAO1 - 。死んだ染色（赤色染色）b）の三日間の3Dプレゼンテーション古いP.用コリスチンおよびヨウ化プロピジウムで24時間の治療を受けてGFPのバイオフィルム緑膿菌 PAO1（ 緑膿菌野生型） - GFPバイオフィルムC 6）PAO1の3D画像のプレゼンテーション- PAO1野生型YFP（黄色）DとCFP pilumの複数形変異体（青））5日齢のPAO1 - GFPバイオフィルムは3Dとして提示画像E）26時間S.出芽酵母 （CEN.PKのバックグラウンドでPTR3変異体）SYTO - 9 15で染色したバイオフィルム。

<ul><li>バブルトラップ、ポリエチレン（DTUシステム生物学、デンマーク工科大学、％の20Center/Resources/Biofilm％の20Setup.aspxをhttp://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument） </li><li>透明なポリプロピレンのプラスチックコネクタとT -コネクタ（コールパーマー、1 / 8インチ（3.175ミリメートル）と1 / 16インチ（1.588ミリメートル）） </li><li>クランプ</li><li>共焦点顕微鏡（Zeiss、メタLSM510） </li><li>カバーグラス、ガラス（クニッテルグレイザー）50 × 24ミリメートル</li><li>カバーガラス、PVCカバースリップ（Rinzl）50 × 24ミリメートル</li><li>フローセル、ポリエチレン（DTUシステム生物学、デンマーク工科大学、％の20Center/Resources/Biofilm％の20Setup.aspxをhttp://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument </li><li>培地ボトル（ショット） </li><li>ペリスタルティックポンプ（ワトソン - マーロウ、205S） </li><li>フローシステムやポンプ用のローリングカート</li><li>シリコン接着剤（3Mスーパーシリコーンシーラントクリア） </li><li>シリンジ5mLの（テルモ） </li><li> SYTO 9（Molecular Probes社） </li><li>針（27G、テルモLU - 100）0.5 mLシリンジ</li><li>廃棄物コンテナ</li></ul>チューブ： <ul><li>シリコンは3ミリメートル、外径は、1mm内径（オレDich） </li><li>シリコンの4 mm、外径は2mm内径（オレDich） </li><li> Marpreneは3ミリメートル、外径は、1mm内径（ワトソン - マーロウ） </li></ul>メディアの<table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 緑膿菌の培地 </td></tr><tr><td> A10 </td><td> G / L </td></tr><tr><td> （NH 4）2 SO 4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 3.0 </td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 mLの1 M CaCl 2を </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100μL/ L微量金属（ 緑膿菌 -バイオフィルム用）4 </td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ</td></tr><tr><td colspan="2"> 1:10の比率でA10とFBを混ぜる。 </td></tr><tr><td colspan="2">所望の濃度に炭素源を追加。 </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiaeの合成完全（SC）培地 </td></tr><tr><td></td><td> G / L </td></tr><tr><td>硫酸アデニン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -トリプトファン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -ヒスチジンHCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -アルギニンHCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L -メチオニン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -チロシン</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -ロイシン</td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L -イソロイシン</td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L -リジンHCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -フェニルアラニン</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -アスパラギン酸</td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L -グルタミン酸</td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L -バリン</td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L -トレオニン</td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L -セリン</td><td> 0.40 </td></tr><tr><td>酵母NITロゲンベースW / Oアミノ酸とアンモニウム（バクト） </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> 6.0 </td></tr><tr><td>コハク酸</td><td> 10.0 </td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td></tr><tr><td>グルコース（別々にオートクレーブ処理） </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

多くの微生物細胞は自由生活微生物に比べて生理学的および病理学的特性を変更したバイオフィルムのように定義されて付着微生物群集を形成する能力を持っている。自然の中でバイオフィルムは、しばしば不十分な定義された条件1の下で調査し、存在することは困難です。透明な基層を使用して、それはデバイスへの簡単なバイオフィルムをリアルタイムに非破壊的方法で調べることのできるシステムが可能です：ここでは、微生物バイオフィルムの in vitro 3D での研究のために、フローセルのモデルシステムの組み立てと動作を実証明確に定義された条件2,3の下で高い再現性を生成する。 システムは、バイオフィルムの成長チャンバーとして機能するフローセルで構成されています。フローセルは、蠕動ポンプを介して培地フラスコから栄養と酸素を供給され、使用済み培地は、廃棄物の容器に集めている。フローシステムのこの構造は、フローチャンバーで培養した細胞の軽微な障害を持つ栄養素と例えば抗生物質の投与を継続的に供給することができます。また、フローセル内の流れの条件は、せん断応力にさらされるバイオフィルムの研究を可能にする。そうでない場合はフローセル内のバイオフィルムの構造を破壊することができるチューブからデバイスの範囲の気泡をトラップする泡。 フローセルシステムでは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）と互換性があり、それによって微生物のバイオフィルムの開発についての非常に詳細な3D情報を提供することができます。バイオフィルム中の細胞を蛍光プローブまたはCLSM分析と互換性のあるタンパク質で標識することができます。これはオンラインで可視化を可能にし、開発するバイオフィルムのニッチの調査を可能にします。微生物の相互関係、抗菌剤の調査や特定の遺伝子の発現は、フローセルシステムで調べることができる多くの実験装置のものである。

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.7K ビュー.  Danish Technical University. プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

免疫・感染学

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

要約

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共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用

長期的な慢性

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定

緑膿菌誘発肺傷害モデル

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレスマウスモデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオフィルム感染症の監視

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

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共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用

長期的な慢性

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定

緑膿菌誘発肺傷害モデル

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレスマウスモデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオフィルム感染症の監視