1. Versammlung der Flow Cell System mit allen Komponenten Die versammelten Flow-System umfasst: autoklavierbar Schläuche, Blasenfallen, medium / Abfallflasche und Messzellen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle diese Teile können zwischen den Experimenten verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Durchflusszelle System-Setup (wesentliche Bestandteile des Setup). Die Messzelle besteht aus mehreren Komponenten: ein Medium-Flasche, eine Schlauchpumpe, Blasenfallen, die Messzelle, ein Abfallbehälter und diverse Teile der Schläuche mit verschiedenen Anschlüssen verbunden. Abbildung mit freundlicher Unterstützung von Rune Lyngklip zur Verfügung gestellt. 2. Versammlung der Durchflusszelle <ol><li> Die Messzelle (Abbildung 2a) ist mit dünnen Bahnen von Silikonkleber, mit einer Spritze (Abb. 3) behandelt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf dem Silikon-Linien (Abbildung 3). Glasdeckgläschen als Substrat für P verwendet aeruginosa, während PVC Deckgläser für S. angewandt werden cerevisiae Biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Durchflusszelle und Blasenfalle 2. Detaillierte Beschreibung der Dimensionen für die Herstellung von a) Flusszelle b) Blasenfalle, DTU Systems Biology verwendet. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von John Wiley &amp; Sons, Inc. (DTU Systems Biology war früher berechtigt Biocentrum, wie in der Abbildung dargestellt) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Illustration der Silikonkleber Anwendung Linien für die Befestigung des Glases Substrat. Die angegebenen Deckglas wird über den Silikon-Kleber platziert, um es auf die Messzelle anschließen. <ol start="3"><li> Schalten Sie die Durchflusszelle um und legen es auf eine ebene Fläche mit dem Deckglas nach unten. Drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite der Messzelle auf das Deckglas auf der Basis der Flusszelle zu schieben. Schalten Sie die Messzelle über und untersuchen für Bereiche, die nicht durch das Silikon abgedichtet sind. Der Griff (Kolben) Teil einer Spritze kann als Werkzeug eingesetzt werden vorsichtig auf die Glas-und Flow-Zelle zusammen. </li></ol> 3. Medium Bottle <ol><li> Legen Sie eine Fütterung Silikonschlauch (2 mm Innendurchmesser) in einem Medium Flasche und legen Sie einen geraden Stecker am anderen Ende. </li><li> Add Medium, um die Flasche (für mittel-Inhalt finden Sie unter &quot;Medien&quot; Absatz) Cover-Anschluss und eine Flasche mit Metallfolie und Autoklaven des Mediums. Stellen Sie sicher, dass das Ende der Zuführrohr oberhalb des Flüssigkeitsspiegels in dem Medium Flasche oder ein Siphon-Effekt ist fest kann leer Medium Flasche beim Autoklavieren. </li></ol> 4. Anschließen der Blasenfalle, Durchflusszelle und Pump Montieren Sie alle Schläuche nach der Gliederung in Abbildung 1. Verwenden Sie Silikonschlauch mit Ausnahme des Teils, der durch die Schlauchpumpe wo Marprene Schläuchen angewendet geht. <ol><li> Um das Rohr aus dem Medium Flasche auf alle einzelnen Strömungskammern verbinden, teilen einen Schlauch in die erforderliche Anzahl von Eingängen in das Experiment eingesetzt. Verwenden Sie T-Anschlüsse, um die gewünschte Anzahl der Verbindungsschläuche aus dem Einfüllstutzen zu machen, um die Marprene Rohre in der Pumpe (siehe Abbildung 1, T-Stecker). Es ist generell eine gute Idee, um die gleiche Sequenz, um von Rohren und Messzellen im gesamten System zu halten, um die Identifizierung von Komponenten im Falle von Fehlern im System zu erleichtern. </li><li> Schließen Sie jedes einzelne Magensonde (2 mm im Durchmesser) zu Röhrchen in die Pumpe mit geraden Steckern Marprene. Schließen Sie das Marprene Schlauch an einer Blasenfalle (Abb. 2b) über die Zwischenstufe Silikonschlauch (1 mm im Durchmesser). Stellen Sie sicher, dass die Pumpe mit dem Eingang befindet sich am höchsten Teil der Blasenfalle verbunden. </li><li> Schließen Sie die resultierende Auslaufrohr der Blasenfallen der Durchflusszelle Einlass (1 mm im Durchmesser), stellen Sie sicher, dass die Länge dieser Schläuche der Messzelle auf die Bühne des konfokalen Mikroskops (typischerweise 1 m) bewegt werden können. </li><li> Platz 5 ml-Spritzen auf der Oberseite des Blasenfallen. Schließen Sie die Tops mit passenden Kappen. </li><li> Auf der Messzelle Steckdose anschließen einer kurzen, ca. 40 mm Stück (1 mm im Durchmesser), Schläuche und die Nutzung einer &quot;Reduzierung&quot; straight-Anschluss zu einem Abfall Rohr befestigen (2 mm im Durchmesser) der benötigten Länge. Legen Abfall Rohre in den Abfallbehälter. </li><li> Wichtig ist, dass die Abfallbehälter stets auf dem gleichen Niveau wie der Fluss-Zellen gelegt werden, nie unter flow-Zell-Ebene. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Ende der Ablaufschlauch über dem erwarteten Niveau von Abfällen Flüssigkeit wird fest mit flush-back zu vermeiden durch einen Siphon-Effekt beim Umgang mit dem Flow-Zellen. </li></ol> 5. STERILISATION und Waschen des FLOW SYSTEM <ol><li> Entfernen Blasenfalle Kappen und legen Sie sie in 70% Ethanol sie steril zu halten. </li><li> Run auf höchstem Pumpendrehzahl, um das System mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit in Wasser zu füllen. &lt;/ Li&gt; <li> Legen Sie die Blasenfalle Kappen wieder auf, wenn die Blasenfallen vollständig ausgefüllt sind. </li><li> Tippen Sie auf den Fluss Zellen zu Blasen in der Strömung Kammer zu entfernen. Achten Sie darauf, die fragile Deckglas Schäden. </li><li> Lassen Sie das System für 3-4 h bei einer Flussrate von 3 ml / h / Kanal (0,2 mm / s linear flow rate) zu sterilisieren. </li><li> Wash System 2-3 mal zu waschen alle Hypochlorit. Füllen und Entleeren der Anlage mit sterilem Wasser. Blasenfallen muss vollständig zwischen jedem Waschen entleert werden. Dies kann durch Einpumpen von Luft bis Blasenfallen geleert worden erfolgen. Nach der Entleerung zu entfernen Kappen von den Blasenfallen vor dem Nachfüllen des Systems. Ersetzen Kappen nach dem Blasenfallen wurden vollständig mit Flüssigkeit gefüllt. Wiederholen Sie je nach Bedarf. </li><li> Run sterilem Wasser durch das System zu einem niedrigen Durchfluss (1-3 ml / h / Kanal) über Nacht oder gehen Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Schließen Sie das Medium Flasche mit dem Einlass und spülen Sie das System mit Medium über Nacht bei niedrigen Durchfluss (3 ml / h / Kanal) bei der Temperatur in dem das Experiment durchgeführt werden soll. Hinweis: Blasenfallen müssen für Wasser entleert werden, bevor das System mit Medium gefüllt ist. </li></ol> 6. Impfung des FLOW CELL <ol><li> Von einer Übernacht-Kultur eine Verdünnung auf eine gewünschte optische Dichte (für P. aeruginosa zB 0,001 OD 600nm und 0,1 OD 600nm für S. cerevisiae). </li><li> Verwenden Sie eine 0,5 ml Spritze mit einer 27G Nadel, um genügend Inokulum laden, um die Kammer zu füllen. 250 ul ist ausreichend für die Strömungskammern mit den Abmessungen in dieser Arbeit angegeben (Abbildung 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Stoppen Sie die Schlauchpumpe. </li><li> Clamp off der Silikonschlauch führt zu der Durchflusszelle zurück zu verhindern fließen in das System. </li><li> Sterilisieren der Impfstelle auf dem Silikonschlauch durch Abwischen mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie die Nadel in den Silikonschlauch und stellen die Spitze in den Einlass der Durchflusszelle. Spritzen Sie das Inokulum in die Kammer (darauf achten, nicht, um Luftblasen zu injizieren). </li><li> Entfernen Sie die Nadel und wischen Sie die Injektionsstelle mit 70% igem Ethanol durch sofortige Abdichtung der Bohrung mit Silikonkleber auf die Injektionsstelle gefolgt. </li><li> Drehen Sie die Durchflusszelle und lassen Sie sich die Mikroorganismen an der Unterlage haften für 1 Stunde ohne Durchströmung der Durchflusszelle. </li><li> Schalten Sie die Messzelle, starten Sie das Medium Pumpe (3 ml / h / Kanal) und nehmen Sie die Klemme aus dem Silikonschlauch. </li><li> Das System ist für den Brutschrank bei 37 ° C im Fall von P. aeruginosa und 30 ° C im Fall von S. cerevisiae. </li><li> Biofilm in den Fluss Kammern können nun visualisiert werden CLSM. </li></ol> 7. Färbung von BIOFILM Für die Mikroskopie <ol><li> Machen Sie eine Verdünnung der entsprechenden Färbung (z. B. 1:1000 Syto 9 live für S. cerevisiae-Färbung) </li><li> Stoppen Sie die Schlauchpumpe. </li><li> Clamp der Silikonschlauch führt zu der Durchflusszelle. </li><li> Sterilisieren Impfstelle auf der Silikonschlauch durch Abwischen mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Sie eine 0,5 ml Spritze mit einer 27G Nadel, genug Färbelösung laden, um die Kammer zu füllen. 250 ul ist ausreichend für die Strömungskammern hier verwendeten. </li><li> Legen Sie die Nadel in den Silikonschlauch und stellen die Spitze in den Einlass der Durchflusszelle. Langsam injizieren die Färbelösung in die Kammer (darauf achten, nicht zu Blasen spritzen). </li><li> Entfernen Sie die Nadel und wischen Sie die Injektionsstelle mit 70% igem Ethanol durch sofortige Abdichtung der Injektionsstelle gefolgt. </li><li> Verlassen Sie die Messzelle ohne Strömung für 15 Minuten. </li><li> Nehmen Sie die Klemme und starten Sie den Strom (3 ml / h / Kanal) </li><li> Erfassung von Daten mit dem CLSM </li></ol>

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Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. 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J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

Wir haben eine Durchflusszelle System, das ein mächtiges Werkzeug in Biofilm Untersuchungen stellt unter Beweis gestellt. In Kombination mit 3D-Bildgebung durch konfokale Mikroskopie, hat das System eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Methoden der Analyse von mikrobiellen Biofilmen mit Hilfe von traditionellen mikroskopischen Techniken. Dieses System ermöglicht 3D-Visualisierung von lebenden mikrobiellen Biofilm Gemeinden ohne Störung der Gemeinschaft. Die Lichtmikroskopie wird keine detaillierten Informationen über Nischen des Biofilms und während der Elektronenmikroskopie bietet nanoskaliger Auflösung des Biofilms, es nicht zulassen, Live Cell Imaging. Mit dem beschriebenen Strömungskanal System, das wir zuvor die räumliche Verteilung der Bakterienzellen empfindlich auf verschiedene Antibiotika 5-8 (Abbildung 4a), die Verteilung der extrazellulären Verbindungen aufgeklärt, wie zB DNA 9-11 und die Verteilung der beweglichen und unbeweglichen Zellen der gleichen Art innerhalb einer bakteriellen Gemeinschaft 4,6,9 (Abbildung 4c). Wir sehen, dass die Messzelle System verwendet werden, um Aspekte der Hefe Biofilme zu untersuchen. Dies kann die räumlich zeitliche Verteilung der Hefe Biofilm als Reaktion auf Umweltfaktoren wie Fungizide sowie die Identifizierung von Genen in Hefe Biofilm Entwicklung einbezogen werden. Obwohl Hefe nicht bekannt ist, in bewegliche und unbewegliche Zellen differenzieren können auch andere Aspekte des Biofilms Diversifizierung Studien wie die morphologische Übergang von der Hefe bis zum pseudohyphal Zellen und die Verlagerung von haploid zu diploiden Zellen werden. Wir haben ein System, das mit mehreren mikrobielle Spezies entsprechen und wird mit mehreren Färbetechniken Arbeit gezeigt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Färbung Sonden und fluoreszierende Proteine, wie GFP, ermöglichen es, bestimmte Nische Untersuchungen in den Entwicklungsländern Biofilm und ist ein effizientes Werkzeug für die Analyse der Wirkung von Antibiotika oder anderen Umweltfaktoren. Die Informationen, die gesammelt werden können, ist sehr detailliert (Abbildung 4) und verfügt in den Biofilm kann mit Computerprogrammen wie COMSTAT 12,13 quantifiziert werden. Insgesamt ist der wichtigste Aspekt des Protokolls der Tatsache, dass es ein zeitaufwändiger Prozess ist. Es ist auch eine Einschränkung, dass die Zellen müssen in der Lage, auf einem nicht-fluoreszierenden, transparenten Oberfläche wachsen. . Da der Biofilm gebildet wird analysiert mit einem konfokalen Mikroskop, die Tiefe, dass untersucht wird, um ein paar hundert Mikrometer 14 begrenzt werden kann, gibt es weitere technische Beschränkungen, die in das Design: Das System ist nicht für das Hochdurchsatz-Screening geeignet, da ein erfahrener Forscher können höchstens 15 Kanäle pro Experiment, das wiederum mehrere Tage dauern kann zur Vorbereitung zu behandeln. Allerdings können Antibiotika oder Mutanten, die als relevant für die Biofilm-Studien werden zunächst Masse mit anderen Methoden wie Kristallviolettfärbung abgeschirmt vor den interessantesten Kandidaten für die Flusszelle System übertragen werden. Der Deckel Glasscheiben sind sehr dünn und brechen leicht, und darauf zu achten, bei der Handhabung der Systeme. Neben den Schlauch sollte täglich während der Laufzeit eines Experiments untersucht werden, als erhebliche &quot;back-Wachstum&quot; in den Einlaßrohre kurz vor der Strömung Zellen auftreten können. Solche Verunreinigungen können durch das Entfernen von mehreren Zentimetern von Silikon-Schlauch von der Eingangsseite der Strömung Zellen gelöst werden, indem sterile Technik. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4 a) 4 Tage alte PAO1 -. GFP Biofilm für 24 Stunden mit Colistin und Propidiumiodid behandelt tot-Färbung (rot angefärbt) b) 3D-Darstellung eines 3 Tage alten P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa Wildtyp) - GFP Biofilm 6 c) 3D-Bild-Darstellung eines PAO1 - CFP pila Mutante (blau) mit einem PAO1 Wildtyp YFP (gelb) d) 5 Tage alten PAO1 - GFP Biofilm als 3D vorgestellt Bild e) 26 h S. cerevisiae (ptr3 Mutanten in CEN.PK Hintergrund) Biofilm mit Syto-9 15 gefärbt.

<ul><li> Blasenfallen, Polyethylen (DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument% 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx) </li><li> Klare Polypropylen-Kunststoff-Anschlüsse und T-Anschlüsse (Cole Parmer, 1 / 8 Zoll (3,175 mm) und 1 / 16 in. (1.588 mm)) </li><li> Clamps </li><li> Konfokalen Mikroskops (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Deckgläser, Glas (Knittel Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Deckgläser, PVC Deckgläser (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Flow-Zellen, Polyethylen (DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument% 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx </li><li> Medium-Flaschen (Schott) </li><li> Schlauchpumpen (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rollwagen für Durchfluss-Systeme und Pumpen </li><li> Silikon-Kleber (3M Super Silicondichtungsmasse Clear) </li><li> Spritze 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml Spritzen mit Kanülen (27G, Terumo LU-100) </li><li> Abfallbehälter </li></ul> Tubing: <ul><li> Silikon, 3 mm Außendurchmesser, 1 mm Innendurchmesser (Ole Dich) </li><li> Silikon, 4 mm Außendurchmesser, 2 mm Innendurchmesser (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm Außendurchmesser, 1 mm Innendurchmesser (Watson-Marlow) </li></ul> Medien <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa Medium </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 mL 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 ul / L Trace Metalle (P. aeruginosa-Biofilme) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix A10 und FB in einem Verhältnis von 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Add Kohlenstoffquelle auf eine gewünschte Konzentration. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae synthetische vollständige (SC)-Medium </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Adeninsulfat </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Histidin-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Arginin-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-Isoleucin </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-Lysin-HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Asparaginsäure </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Hefe Nitrogen Basis w / o Aminosäuren und Ammonium (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Ammoniumsulfat </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> Bernsteinsäure </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucose (getrennt autoklaviert) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

Viele mikrobielle Zellen haben die Fähigkeit, sessile mikrobielle Gemeinschaften wie Biofilmen, die physiologischen und pathologischen Eigenschaften verändert haben im Vergleich zu frei lebenden Mikroorganismen definierte Form. Biofilme in der Natur sind oft schwer zu untersuchen und unter schlecht definierten Bedingungen 1 befinden. Mit einem transparenten Substrat ist es möglich, Gerät ein System, wo einfache Biofilmen in eine nicht-destruktive Weise in Echtzeit untersucht werden kann: hier zeigen wir die Montage und den Betrieb einer Durchflusszelle Modellsystem für in vitro 3D-Untersuchungen der mikrobiellen Biofilmen Erzeugung hoher Reproduzierbarkeit unter genau definierten Bedingungen 2,3. Das System besteht aus einer Flow-Zelle, die als Klimakammer für die Biofilm dient. Die Messzelle ist mit Nährstoffen und Sauerstoff aus einem Medium Kolben über eine peristaltische Pumpe zugeführt und verbrauchte Medium wird in einem Abfallbehälter gesammelt. Dieser Aufbau des Flow-System ermöglicht eine kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen und Verwaltung von zB Antibiotika mit minimaler Störung der Zellen in der Strömungskammer gewachsen. Darüber hinaus ermöglichen die Strömungsverhältnisse innerhalb der Durchflusszelle Studien von Biofilm ausgesetzt Schubspannung. Eine Blase Auffangeinrichtung Grenzen Luftblasen aus dem Schlauch, die sonst der Biofilm-Struktur in der Durchflusszelle stören könnten. Die Durchflusszelle System ist kompatibel mit konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) und kann dadurch eine sehr detaillierte 3D-Informationen zur Entwicklung von mikrobiellen Biofilmen. Cells im Biofilm kann mit fluoreszierenden Sonden oder Proteine ​​mit CLSM-Analyse bezeichnet werden. Dies ermöglicht Online-Visualisierung und ermöglicht Untersuchungen von Nischen in den Entwicklungsländern Biofilm. Mikrobielle Zusammenhang, Untersuchung von antimikrobiellen Wirkstoffen oder die Expression bestimmter Gene, sind die vielen Versuchsaufbauten, die in der Durchflusszelle System untersucht werden kann.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

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Serie: Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Zusammenfassung

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