وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية السويدية (K2009 - 75SX - 21028-01 - 3 ، K2008 - 61X - 20700 - 01 - 3) ؛ FONCICYT 000000000091984 ؛ أسس Jeansson ، Söderström sjukhemmet Königska ، Lundqvist مارثا وسيجورد إلسا اوتش Goljes Minne ، والجمعية السويدية للطب SLS - 95151. مع التقدير والإمتنان أستاذ الجينات دال بلوك ، جامعة كاليفورنيا ، للتعليق على مخطوطة ثمينة. نشكر الدكتور مايكل اندانج والدكتور Johard هيلانة لحاصرات قنوات HCN ، والأستاذ عبد السيد Manira من أجل توفير المجهر الفيديو. الاعتبارات الأخلاقية : أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها ومعهد كارولينسكا &quot;في ستوكهولم Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات مع نية للحد من أي إزعاج أو الضغط الممكنة للحيوان.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures.">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li><li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals.">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li><li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization.">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker.">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li><li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-/-+mice.">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li><li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+clock+nucleus:+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light.">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li><li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization.">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li><li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

منافع ومساوئ التكنولوجيا مع مراسل luciferase على النقيض من الأساليب فيفو السابقين ، مثل RT - PCR ، التهجين في الموضع وصمة عار الغربية التي تتطلب أخذ عينات الأنسجة في العديد من النقاط الزمنية المختلفة (إعطاء القرار وقت انخفاض ساعات 2-4 عادة اعتمادا على وتيرة أخذ العينات) من أجل دراسة نهاري الاختلافات في التعبير عن الجينات والبروتينات ، والتكنولوجيا مراسل luciferase يسمح عالية الدقة (1-10 دقيقة) دراسات التذبذبات الإيقاعية لعدة أيام في إعداد نفسها. دراسات وهكذا ، يتم تصغير عدد الحيوانات المستخدمة ومفصلة للتأثيرات على مرحلة وفترة ممكنة الإيقاع ، والتي عادة لا يمكن استخدام تقنيات أخذ العينات التقليدية مع القرار مرة منخفضة. لكن ، على الرغم من قياسات السعة النسبية للإيقاع ممكنة ، ينبغي التأكيد على أن التكنولوجيا مراسل ليس الكمية وبالتالي لا يمكن استخدامها لقياس كميات من الجينات المتحولة أو البروتينات ترجمتها. يمكن بدء التسجيلات تحليل الأنسجة ومباشرة بعد زراعة ، وهي ميزة كبيرة لدراسة آثار مباشرة في الضغط الجزيئي للالحية ، في ضوء التحولات فيفو المرحلة التي يسببها إلخ الثقافة SCN عضوي النمط يسمح على المدى الطويل (أسابيع) التلاعب الدوائية من الدماغ الكبار الأنسجة التي تحتوي على شبكة سليمة متشابك نضجا والتكنولوجيا مراسل luciferase يسمح التسجيلات مستقرة لعدة أسابيع. وبالتالي ، فإن الأنسجة لا تحتاج إلى أن يكون الولدان بعد الولادة أو في وقت مبكر من أجل الحصول على ثقافات صحية ، وعلى النقيض من العلاجات الدوائية شريحة الحادة المزمنة يمكن أن يؤديها. على النقيض من البلازميد ، مراسل transfections في مزارع الخلايا ، والتي لا تؤدي إلى أي دمج الحمض النووي في الجينوم ، والمعدلة وراثيا luciferase الحيوانات النماذج (وكذلك transfections lenti الفيروسات) مواتية إذا تعديلات جينية هي التي يتعين دراستها. وينبغي في هذا السياق أيضا يمكن الإشارة إلى أن التصوير التلألؤ في الوقت الحاضر هو ممكن مع اتفاقية مكافحة التصحر كاميرات حساسة للغاية 11 ، والسماح التسجيلات حتى في الخلايا العصبية SCN واحدة (~ 60-10 ميكرون) ، وأنواع الخلايا الأخرى ، والتي تستخدمها المختبرات الكبرى تدرس ايقاعات كل يوم. أخيرا ، والمحققين عادة ما تستخدم عدة الإيقاعية رصد الجزيئي باستخدام التعبير للصحفيين الأخرى ، مثل البروتين في نيون الخضراء ، من أجل دراسة الجينات ساعة / التذبذبات بروتين 16-19. جوانب شريحة سمك يمكن تخفيض سمك الموصى بها هنا للشريحة SCN (200-300 ميكرون) ، أو زيادة الرغبة. ومع ذلك ، على الرغم من أن الأنسجة مسطحا على الغشاء بعد بضعة أيام في الثقافة ، فمن غير المستحسن أن تتجاوز 500 ميكرومتر من سمك شريحة قطع في البداية من أجل الحفاظ على سلامة النسيج 7. أرق شريحة من 100 ميكرون هو من الأسباب الميكانيكية والعملية من الصعب التعامل معها. لأن الأنسجة غير المتجانسة SCN سمك شريحة قد تؤثر على مرحلة من مراحل الانتاج إشارة luciferase ، لأن المناطق المختلفة داخل SCN (على سبيل المثال &quot;الأساسية&quot; في مقابل &quot;وهمية&quot; ، والمناطق الظهرية مقابل بطني) التأرجح مع مختلف مراحل 20 و تفاضلي إعادة مزامنة بعد مرحلة تحولات القرن 21. سمك شريحة يؤثر أيضا على خط الأساس لعدد فوتون منذ أكثر الأنسجة تنبعث منه أكبر عدد من الفوتونات. بهذه الطريقة قد اتساع الاهتزازات الجزيئية تتأثر بشكل غير مباشر على حجم ازدراع. لهذه الأسباب ، ينبغي أن تحكم والثقافات المعالجة تكون دائما من نفس السمك والحجم والتي تحتوي على نفس المنطقة من اللجنة الدائمة للتغذية من أجل التأرجح في المرحلة نفسها ، والسعة مع نفسه. نواة two من جانب واحد ، من ناحية أخرى ، تتأرجح في مرحلة مع بعضها البعض ومع سعة مماثلة طالما vibratome قطع أفقي وليس الزاوية (والتي هي بدورها تعتمد على أن الفصل بين قطع المخيخ ونصفي الكرة الأرضية هو عمودي على سطح الطاولة). قد محقق الذي يؤدي استزراع SCN التجربة أن الثقافات SCN لا تتذبذب في مرحلة مع بعضها البعض. ممارسة وتوحيد أسلوب التقطيع ، أي تقطع دائما على مستوى شرائح rostro - الذيلية نفس اللجنة الدائمة للتغذية ، وسوف تحسين النتيجة. خطوات حاسمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امدادات الاوكسجين أمر بالغ الأهمية. لأن الدماغ يتطلب الكثير من الأكسجين 22 ، إجراء تشريح يحتاج إلى أن تكون سريعة (وكلما 3،1-3،10 هو 5-6 دقائق ~ كلما كان ذلك أفضل من أجل الحفاظ على الأنسجة السليمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجنة الفرعية للتغذية حساس للتغيرات في درجة الحرارة وتبادل المتوسط. اللجنة الفرعية للتغذية حساس درجة الحرارة والتغيرات في درجات الحرارة يمكن أن مرحلة التحول الكبير في تنظيم ضربات القلب ويسبب القطع التجريبية 23. إذا كان يتم تبادل متوسطة أو الحلول أو وأضاف خلال تجربة الجارية ، على سبيل المثال عند تطبيق المخدرات بعد بضعة أيام في الثقافة والمتوسطة أو محلولن يجب أن يكون مسبقا لحرارة 36-37 درجة مئوية (في نفس درجة حرارة في الغرفة) قبل الإضافة. في التجارب الدوائية التي تنطوي على تبادل المتوسطة ، فمن المهم دائما للعمل مع الخلية قبل مكيفة متوسطة الثقافة. إضافة / غسل خارجا مع الطازجة والمتوسطة يمكن أن تحول دون شروط ، المرحلة يحتمل الإيقاع SCN 24 الجزيئية فضلا عن غيرها من الثقافات نوع من الخلايا 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسطة التكوين. من المهم أن الثقافة في نسيج الحموضة الصحيح والأسمولية. المتوسط ​​الجوية التخزين المؤقت يحتوي على كمية كبيرة من HEPES ، التي لديها القدرة العازلة الأمثل في نطاق 6،8-8،2 درجة الحموضة ومناسب أيضا لدرجة الحموضة التخزين المؤقت التغييرات التي قد تحدث نتيجة للتنفس الخلية. HEPES ، من ناحية أخرى ، أكثر حساسية لتغيرات درجة الحرارة مقارنة مع بيكربونات الصوديوم ، والتي يتم تضمينها في كميات صغيرة في المتوسط ​​الثقافة. بيكربونات الصوديوم لديها قدرة أكبر على التخزين المؤقت في الجزء الأسفل من الرقم الهيدروجيني (5،1-7،1) مجموعة 26 ، وبالتالي المناسبة في جو 2 CO. ومع ذلك ، زادت كميات من بيكربونات الصوديوم في الهواء المتوسطة التخزين المؤقت (DMEM 2902) يزيد بشكل ملحوظ والأسمولية لا يمكن إضافتها في وقت واحد دون تمييع المتوسط ​​، والتي تؤدي بدورها في تكوين غير صحيح من الأمينية الفيتامينات والأحماض والأيونات. نصيحة لإعداد المتوسط ​​: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يكون دقيقا وحذرا عند خلط المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحلول الأسهم الطازجة فقط أو إذابة حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة الأسمولية عالية جدا لا يستحق تمييع. وسوف أكثر من 5-6 ٪ ، المخفف المتوسط ​​المرجح عدم العمل. استخدام D - غلوكوز لزيادة الأسمولية إذا كانت منخفضة جدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرحلة التحولات بسبب الوقت اللازم لإعداد وقت إعداد شريحة أمر بالغ الأهمية. يتم الحصول على الحد الأدنى من الصفر أو تأثير على المرحلة إذا تم تنفيذ الإجراء شريحة بين 6-12 ZT 12. يجب أن يتم تنفيذ جميع تشريح شريحة في المرحلة نفسها من الدورة النهارية أو الإيقاعية من أجل تقليل الخطأ بسبب التفاوت بين مرحلة التحضيرات. </li></ol> التعديلات الممكنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالكهربية SCN الحادة ، وتشريح لابد من تنفيذها مع رينغر (السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي ؛ ACSF) العازلة ، ومشبع بالأكسجين (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) ، قبل ان يبدأ تشريح. مزيد من الأوكسجين الاحتياجات التي يمكن ان تضاف باستمرار إلى المخزن المؤقت أثناء إجراء تشريح كامل ، حيث أن النشاط الكهربائي ومتشابك يعتمد مباشرة على امدادات الاوكسجين 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا شرائح أفقية والسهمي تكون مستعدة بنجاح والمثقفين من العقدة. الكتاب لديهم خبرة في التسجيلات luciferase شرائح أفقية ، والتي وفقا لخبرتنا تعطي التذبذبات الإيقاعية مع انخفاض السعة بالمقارنة مع خفض الاكليلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجنة الفرعية للتغذية ما يقرب من 1 ملم طويلة rostro - caudally واستهدفت تقنية التقطيع وصفها هنا من أجل الحصول على مقطع SCN في المنطقة الوسطى. ومع ذلك ، يمكن الحصول على أكثر من مقطع واحد من SCN الماوس وأدمغة الفئران ، والسماح للتحقيق في التعبير الجيني / البروتين الإيقاعية في مستويات أكثر منقاري مقابل الذيلية للنواة SCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا الثقافات شريحة أصغر سنا من الحيوانات ، والجراء بعد الولادة أو حتى الأجنة ، ويكون مستعدا. يرجى ملاحظة أن الدماغ في جمجمة والجراء الصغار جدا وناعمة جدا وحساسة. بالإضافة إلى ذلك ، في العصب البصري هو رقيق وليس تطويره بالكامل. أخذ الحذر عند تشريح الدماغ من الجراء حتى لا تلف المنطقة SCN. على سبيل المثال ، لا يمكن الصغرى مقراض أدوات يمكن استخدامها لفتح الجمجمة من الجراء الماوس لأنها كبيرة جدا. مقص الغرامة تكفي لقطع الأنسجة الناعمة في الجراء الصغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا تغطية تقنية الزجاج ثقافة تستند صفها هنا يمكن استخدامها لالتلألؤ الصورة باستخدام كاميرا CCD / EM - CCD ، وأيضا في الخلايا العصبية SCN واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المركزية الاخرى في مناطق الجهاز العصبي والأنسجة الطرفية من الجهاز PER2 المعدلة وراثيا : يمكن للحيوانات يمكن الحصول عليها بسهولة لوك ، مثقف وتحليلها من حيث التذبذبات الجزيئي ، كما PER2 : لوك التعبير لا تزال تتأرجح لعدة أيام أيضا في عدد من الأنسجة الأخرى أنواع الخلايا و 10. معظم هذه الأنسجة الطرفية ، على سبيل المثال الكبد ، لا تتطلب غشاء من أجل البقاء ولكن بدلا من ذلك المثقف استحم مباشرة في 11 المتوسط. يرجى ملاحظة أن مرحلة التحول بسبب sectioning ، زراعة وتبادل المتوسطة قد لا تتبع نفس المبادئ للجنة الدائمة. </li></ol> أهمية الماوس في الفئران المعدلة وراثيا وسلالات (mPER2 : لوك ؛ mPer1 لوك ​​8 ، 10 ، 27) luciferase يعكس نشاط انزيم البروتين أو الإيقاعات والتعبير الجيني يمكن تقييمها من خلال تسجيل تلألؤ بيولوجي. وتلألؤ بيولوجي luciferase المولدة يعطي إشارة ضعيفة ولكن التألق خلفية قريبة من الصفر ، مما يجعل هذه الطريقة مفيدة. وعلاوة على ذلك ، لأن جزيء luciferase غير مستقرة تتحلل بسرعة وليس هناك فتاهتسميم أذني ، والتي يمكن أن تظهر خلال فترة طويلة الأجل إنارة مثير 28. أخذت معا ، هذه الخصائص تسمح للتجارب طويلة الأمد مما يجعل هذه التكنولوجيا مراسل luciferase مفيدا للغاية في مجال البحوث الإيقاعية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

مركزية الإيقاعية (~ 24 ساعة) على مدار الساعة يوميا في تنسيق إيقاعات الفيزيولوجيا والسلوك يكمن في التأقلم النواة (SCN) وتقع في منطقة ما تحت المهاد الأمامي. مزامنة مباشرة على مدار الساعة من الضوء عبر شبكية العين والعصب البصري. تتولد من خلال التفاعل اليومي التذبذبات حلقات ردود فعل سلبية من عدد من ما يسمى &quot;جينات الساعة&quot; ومنتجات البروتين ، بما في ذلك الفترة (لكل) الجينات. الساعة الأساسية هي أيضا تعتمد على الاستقطاب الغشاء ، والكالسيوم ومخيم 1. اللجنة الفرعية للتغذية ويبين التذبذبات اليومية في التعبير الجيني على مدار الساعة ، والنشاط الأيضي والنشاط الكهربائي التلقائي. بشكل ملحوظ ، وهذا النشاط لا يزال مستمرا في دوري الذاتية شرائح أنسجة البالغين من العقدة 2-4. بهذه الطريقة ، يمكن بسهولة على مدار الساعة البيولوجية دراستها في المختبر ، مما يسمح للتحقيقات الجزيئية ، والكهربية والأيضية وظيفة جهاز تنظيم ضربات القلب. اللجنة الفرعية للتغذية هو صغير ، واضحة المعالم بنية ثنائية الحق يقع فوق chiasm البصرية 5. في الفئران أنه يحتوي على خلايا عصبية ~ 8.000 في كل نواة ، ولها أبعاد ما يقرب من 947 ميكرومتر (الطول ، محور rostrocaudal) × 424 ميكرومتر (عرض) × 390 ميكرون (الارتفاع) 6. تشريح خارج SCN فمن الضروري خفض شريحة الدماغ على مستوى معين من الدماغ حيث يمكن التعرف على اللجنة الفرعية للتغذية. هنا ، نحن تصف الإجراء تشريح وتقطيع اللجنة الدائمة للتغذية ، الذي يشبه الفأر ولأدمغة الفئران. كذلك ، وتبين لنا كيف أن الثقافة تشريح الأنسجة organotypically على غشاء 7 ، وضعت لتقنية زراعة الأنسجة SCN بواسطة يامازاكي وآخرون 8. أخيرا ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام أنسجة معدلة وراثيا لقياس التعبير عن الجينات ساعة / البروتينات باستخدام التكنولوجيا الحيوية مراسل luciferase ، وهو الأسلوب الذي كان في الأصل يستخدم لقياس الإيقاعية التي Geusz آخرون 9. نستخدم هنا الأنسجة SCN المعدلة وراثيا من المغلوب في PERIOD2 : LUCIFERASE الفئران التي تنتجها يو 10 آخرون. الفئران تحتوي على البروتين الانصهار الفترة (PER) (2) والانزيم LUCIFERASE يراعة. عندما تتم ترجمة PER2 في حضور الركيزة لluciferase ، أي luciferin ، يمكن رصدها على النحو PER2 التعبير عندما luciferase تلألؤ بيولوجي يحفز أكسدة luciferin. عدد الفوتونات المنبعثة يرتبط بشكل إيجابي في كمية البروتين PER2 المنتجة ، وعلى ايقاعات تلألؤ بيولوجي ايقاع المباراة PER2 البروتين في الجسم الحي 10. ويمكن بهذه الطريقة يكون الاختلاف في التعبير دوري PER2 رصد مستمر في الوقت الحقيقي خلال عدة أيام. وقد بروتوكول نتبع لزراعة الأنسجة وتسجيل الوقت الحقيقي تلألؤ بيولوجي صفها بدقة من قبل يامازاكي وتاكاهاشي 11.

Watch this Scientific Journal Video about Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus at JoVE.com

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

وذكرت وإجراءات إعداد شرائح تحتوي على الكبار الماوس طائي التأقلم النواة (SCN) ، وسيلة سريعة للثقافة نسيج العقدة في حالة الثقافة عضوي النمط. علاوة على ذلك ، وصفت قياس متذبذبة على مدار الساعة التعبير الجيني البروتين الحيوي باستخدام التكنولوجيا مراسل luciferase.

إعداد شريحة ، التثقيف الأنسجة وتسجيل Luciferase عضوي النمط من النشاط الجيني في نواة ساعة التأقلم

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.0K Views.  Karolinska Institutet. وذكرت وإجراءات إعداد شرائح تحتوي على الكبار الماوس طائي التأقلم النواة (SCN) ، وسيلة سريعة للثقافة نسيج العقدة في حالة الثقافة عضوي النمط. علاوة على ذلك ، وصفت قياس متذبذبة على مدار الساعة التعبير الجيني البروتين الحيوي باستخدام التكنولوجيا مراسل luciferase.

Video: Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

وعضوي النمط الثقافة شريحة الحصين النموذجي لفحص الإصابات متعلق بالخلايا العصبية

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

تسجيل وتحليل إيقاعات الساعة البيولوجية في تشغيل عجلة النشاط في القوارض

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.