Ce travail a été financé par le Conseil suédois de la recherche médicale (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; les fondements de la Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Martha Lundqvist et Sigurd och Elsa Goljes Minne et la Société suédoise de médecine SLS-95151. Professeur Gene D. Block, UCLA, est remerciées pour leurs précieux commentaires sur le manuscrit. Nous remercions le Dr Michael Andäng et le Dr Hélène Johard pour le bloqueur des canaux HCN, et le professeur Abdel El-Manira pour fournir des vidéo-microscope. Considérations éthiques: Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Institut Karolinska et de &quot;Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Toutes les expérimentations animales sont réalisées avec l&#39;intention de minimiser tout éventuel stress ou d&#39;inconfort à l&#39;animal.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. 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Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. 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T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

Avantages et inconvénients de la technologie rapporteur de la luciférase Contrairement à l&#39;ex méthodes in vivo, comme la RT-PCR, hybridation in situ et Western blot qui nécessitent l&#39;échantillonnage des tissus à de nombreux points de temps différentes (donnant une résolution temporelle faible normalement 2-4 heures selon la fréquence d&#39;échantillonnage), afin d&#39;étudier diurnes les variations dans les expressions des gènes et des protéines, la technologie permet rapporteur de la luciférase à haute résolution (1-10 min) des études sur les oscillations circadiennes pendant plusieurs jours dans la même préparation. Des études Ainsi, le nombre d&#39;animaux utilisés est réduit au minimum et détaillée des effets sur la phase et la période du rythme sont possibles, ce qui n&#39;est normalement pas possible en utilisant des techniques d&#39;échantillonnage classiques avec une résolution temporelle faible. Cependant, bien que les mesures d&#39;amplitude relative de rythme sont possibles, il convient de souligner que la technologie journaliste n&#39;est pas quantitatif et ne peut donc pas être utilisés pour mesurer les quantités de gènes transcrits ou des protéines traduites. Les enregistrements de tissu peut être démarré et analysés immédiatement après mise en culture, un grand avantage pour étudier directement les effets du stress moléculaire in vivo, en phase de changements in vivo induite par la lumière etc La culture organotypique SCN permet à long terme (semaines) la manipulation pharmacologique du cerveau adulte tissu contenant une intactes réseau mature synaptique et la technologie rapporteur luciférase permet des enregistrements stables pendant plusieurs semaines. Ainsi, le tissu n&#39;a pas besoin d&#39;être postnatale néonatale ou tôt afin d&#39;obtenir des cultures saines, et contrairement à la tranche aiguë chronique traitements pharmacologiques peuvent être effectuées. Contrairement à un plasmide reporter de transfections dans des cultures cellulaires, ce qui ne pas conduire à l&#39;incorporation de l&#39;ADN dans le génome, la luciférase transgéniques-modèles animaux (ainsi que lenti-virus transfections) sont favorables si altérations épigénétiques sont à étudier. Il devrait dans ce contexte également être mentionné que l&#39;imagerie de luminescence est aujourd&#39;hui possible avec des caméras CCD très sensible 11, qui permet des enregistrements même en neurones SCN unique (~ 60-10 um) et d&#39;autres types cellulaires, utilisés par les grands laboratoires étudient les rythmes circadiens. Enfin, plusieurs enquêteurs circadien utilisent couramment le suivi d&#39;expression moléculaire en utilisant d&#39;autres reporters, comme la protéine fluorescente verte, afin d&#39;étudier des gènes d&#39;horloge / oscillations protéines 16-19. Aspects de l&#39;épaisseur de coupe Les épaisseurs recommandé ici de la tranche SCN (200-300 um) pourrait être réduit ou augmenté, si désiré. Cependant, bien que le tissu s&#39;aplatit sur ​​la membrane après quelques jours de culture, il est recommandé de ne pas dépasser 500 um d&#39;épaisseur de la tranche d&#39;abord coupé afin de préserver la viabilité du tissu 7. Une tranche mince de 100 um est de raisons mécaniques et pratiques difficiles à manipuler. Parce que le tissu SCN est hétérogène de l&#39;épaisseur de la tranche peut affecter la phase du signal de sortie de la luciférase, depuis les différentes régions au sein du SCN (par exemple le «noyau» par rapport à la «coquille», et les régions dorsale par rapport ventrale) oscillent avec les différentes phases 20 et différentiellement re-synchroniser après déphasages 21. L&#39;épaisseur de la tranche affecte également la base du nombre de photons, depuis plus de tissu émet un plus grand nombre de photons. L&#39;amplitude des oscillations moléculaires peuvent de cette manière être indirectement affectés par la taille de l&#39;explant. Pour ces raisons, le contrôle et les cultures traitées doivent toujours être de la taille, la même épaisseur et contenant la même région du SCN afin d&#39;osciller dans la même phase et avec la même amplitude. Les deux noyaux unilatérale, d&#39;autre part, oscillent en phase les uns avec les autres et avec des amplitudes similaires aussi longtemps que la coupe vibratome est horizontal et non incliné (qui à son tour dépend de celui de la séparation nette entre le cervelet et les deux hémisphères est perpendiculaire la surface de la table). L&#39;enquêteur qui effectue la culture SCN pourraient éprouver que les cultures SCN ne oscillent en phase les uns avec les autres. Pratiquer et la standardisation de la technique de tranchage, à savoir les tranches sont toujours coupées à la même rostro-caudale niveau de la SCN, permettra d&#39;améliorer le résultat. Les étapes critiques <ol><li> D&#39;alimentation en oxygène est critique. Parce que le cerveau a besoin de beaucoup d&#39;oxygène 22, la procédure de tranchage doit être rapide (Le plus proche est de 03/01 à 03/10 ~ 5-6 minutes, le mieux c&#39;est dans le but de garder les tissus sains). </li><li> Le SCN est sensible aux changements de température et d&#39;échange à moyen terme. Le SCN est sensible à la température et les changements de température peuvent grands déphasage du stimulateur cardiaque et provoquer des artefacts expérimentaux 23. Si le milieu ou les solutions sont échangés ou ajouté lors d&#39;une expérience en cours, par exemple lors de l&#39;application d&#39;un médicament après quelques jours de culture, le milieu ou la solution doit être préchauffée à 36-37 ° C (la température de même que dans la chambre) avant l&#39;addition. Dans les expériences pharmacologiques qui impliquent des échanges moyen, il est important de toujours travailler avec pré-conditionné milieu de culture cellulaire. Ajout / wash-out avec des produits frais, moyen inconditionnée peut potentiellement déphasage du rythme SCN 24 moléculaires ainsi que d&#39;autres cultures de cellules de type 25. </li><li> La composition du milieu. Il est important de la culture de tissus dans bon pH et l&#39;osmolalité. Le milieu de l&#39;air-tampon contient une grande quantité d&#39;HEPES, qui a une capacité tampon optimale dans la gamme de pH 6.8 à 8.2 et est également approprié pour la mise en mémoire tampon des changements de pH qui peuvent survenir à la suite de la respiration cellulaire. HEPES, d&#39;autre part, est plus sensible aux variations de température par rapport au bicarbonate de sodium, qui est inclus en petites quantités dans le milieu de culture. Le bicarbonate de sodium a une capacité plus grande mémoire tampon dans le bas du pH (05/01 au 07/01) rang 26, donc approprié dans une atmosphère de CO 2. Cependant, l&#39;augmentation des quantités de bicarbonate de sodium dans le milieu de l&#39;air-buffering (DMEM 2902) augmente significativement l&#39;osmolalité et ne peuvent pas être ajoutés sans simultanément dilution du milieu, ce qui entraîne à son tour dans la composition incorrecte d&#39;acides aminés, des vitamines et des ions. Conseils pour la préparation du milieu: <ol><li> Soyez précis et prudent quand mélanger le médium. </li><li> Utilisez des solutions stock uniquement frais ou fraîchement décongelé. </li><li> En cas d&#39;osmolalité très élevé, il ne vaut pas diluer. Plus que 5-6% de la dilution moyenne sera très probablement ne fonctionnera pas. Utilisez le D-glucose pour augmenter l&#39;osmolalité si elle est trop faible. </li></ol></li><li> Déphasages dus au temps de préparation Le temps de préparation de tranches est critique. Effet nul ou minime sur la phase est obtenue si la procédure de tranche est réalisée entre ZT 6 au 12 décembre. Tous les dissections tranche devrait être réalisée à la même phase du cycle circadien diurne ou afin de minimiser les erreurs dues à la variation entre la phase des préparatifs. </li></ol> D&#39;éventuelles modifications <ol><li> Pour électrophysiologie SCN aiguë, le tranchage doit être réalisé avec une sonnerie (Artificial liquide céphalorachidien; ACSF) tampon, saturée en oxygène (95% d&#39;O 2, 5% CO 2) avant le début de tranchage. En outre, l&#39;oxygène doit être ajouté en continu à la mémoire tampon pendant toute la procédure de tranchage, de l&#39;activité électrique et synaptique est directement dépendante de l&#39;apport d&#39;oxygène 22. </li><li> Tranches horizontales et sagittal peut également être préparé avec succès et cultivée de la SCN. Les auteurs ont de l&#39;expérience avec des enregistrements luciférase en tranches horizontales, ce qui, selon notre expérience donnent oscillations circadiennes avec faible amplitude par rapport à la coupe coronale. </li><li> Le SCN est d&#39;environ 1 mm de long rostro-caudales et la technique de découpage décrite ici est orientée vers l&#39;acquisition d&#39;une section SCN dans la région centrale. Cependant, plus d&#39;une section SCN peuvent être obtenus auprès de la souris et cerveaux de rats, permettant à l&#39;enquête sur circadien gène / protéine d&#39;expression à des niveaux plus rostrale par rapport caudale du noyau du RCS. </li><li> Trancher les cultures de jeunes animaux, chiots postnatale, ou même des embryons, peut également être préparé. S&#39;il vous plaît noter que le cerveau et le crâne chez les chiots très jeunes enfants sont très doux et sensible. En outre, le nerf optique est mince et pas complètement développé. Prenez garde en disséquant le cerveau des bébés afin que la région SCN n&#39;est pas endommagé. Par exemple, des outils de micro rongeur ne peut pas être utilisé pour ouvrir le crâne des bébés souris, car elles sont trop grosses. Ciseaux fins suffisent pour couper les tissus mous de jeunes chiots. </li><li> Le couvercle en verre de la culture technique basée décrites ici peuvent aussi être utilisés pour la luminescence image à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD / EM-CCD, également dans les neurones SCN unique. </li><li> Autres régions centrales du système nerveux et des tissus d&#39;organes périphériques à partir transgéniques PER2:: LUC animaux peuvent être facilement obtenus, cultivés et analysés en termes d&#39;oscillations moléculaires, comme la PER2:: expression LUC continue à osciller pendant plusieurs jours aussi dans un certain nombre d&#39;autres tissus types de cellules et 10. La plupart de ces tissus périphériques, pour le foie, par exemple, ne nécessitent pas une membrane pour la survie, mais sont plutôt cultivées directement baigné dans le milieu 11. S&#39;il vous plaît noter que le déphasage dû à la coupe, la culture et l&#39;échange moyennes peuvent ne pas suivre les mêmes principes que pour SCN. </li></ol> Signification Dans des souris transgéniques et les souches de rat (mPER2:: LUC; mPer1-Luc 8, 10, 27) l&#39;activité enzyme luciférase reflète protéines ou des rythmes expression des gènes et peut être évaluée par l&#39;enregistrement de bioluminescence. La bioluminescence luciférase produite donne un signal faible mais la luminescence de fond est proche de zéro, ce qui rend cette méthode avantageuse. Par ailleurs, parce que la molécule est instable et la luciférase rapidement dégradé il n&#39;ya pas de phototoxicité, qui peuvent apparaître pendant une longue illumination excitateurs 28. Pris ensemble, ces propriétés permettent à long terme des expériences rendant la technologie rapporteur luciférase très avantageux dans la recherche du rythme circadien.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

Une centrale circadien (~ 24 h) coordonner l&#39;horloge rythmes quotidiens dans la physiologie et le comportement réside dans le noyau suprachiasmatique (NSC), situé dans l&#39;hypothalamus antérieur. L&#39;horloge est directement synchronisé par la lumière via la rétine et du nerf optique. Oscillations circadiens sont générés par l&#39;interaction des boucles de rétroaction négative d&#39;un certain nombre de soi-disant «gènes de l&#39;horloge» et leurs produits protéiques, y compris la période (Per) des gènes. L&#39;horloge de base est également dépendante de dépolarisation de la membrane, le calcium et le camp 1. Le SCN indique oscillations quotidiennes de l&#39;expression des gènes d&#39;horloge, l&#39;activité métabolique et activité électrique spontanée. Remarquablement, cette activité cyclique endogène persiste dans des tranches de tissu adulte du SCN 2-4. De cette façon, l&#39;horloge biologique peut facilement être étudié in vitro, permettant d&#39;enquêtes moléculaires, électrophysiologiques et métaboliques de la fonction de stimulateur cardiaque. Le RCS est un petit, bien définis structure bilatérale situé juste au-dessus du chiasma optique 5. Chez le rat qu&#39;il contient ~ 8.000 neurones dans chaque noyau et a des dimensions d&#39;environ 947 um (longueur, axe rostrocaudal) x 424 um (largeur) x 390 um (hauteur) 6. Pour disséquer le SCN, il est nécessaire de couper une tranche de cerveau au niveau spécifique du cerveau où le SCN peuvent être identifiés. Ici, nous décrivons la procédure de dissection et tranchage du SCN, qui est semblable pour les souris et les cerveaux de rats. En outre, nous montrons comment la culture des tissus disséqués organotypically sur une membrane 7, une technique développée pour la culture de tissus SCN par Yamazaki et al. 8. Enfin, nous montrons comment les tissus transgéniques peuvent être utilisés pour mesurer l&#39;expression des gènes de l&#39;horloge / protéines en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase, une méthode qui était à l&#39;origine utilisé pour les mesures du rythme circadien par la Geusz et al. 9. Nous avons ici l&#39;utilisation des tissus de la SCN transgéniques knock-in période2:: souris luciférase produite par Yoo et al 10.. Les souris contiennent une protéine de fusion de PÉRIODE (PER) 2 et l&#39;enzyme luciférase Firefly. Lorsque PER2 est traduit dans la présence du substrat de la luciférase, c&#39;est à dire la luciférine, l&#39;expression PER2 peut être contrôlé que lorsque la bioluminescence luciférase catalyse l&#39;oxydation de la luciférine. Le nombre de photons émis est positivement corrélée à la quantité de protéine produite PER2, et les rythmes de bioluminescence adapté au rythme des protéines in vivo PER2 10. De cette façon, la variation cyclique de l&#39;expression PER2 peuvent être surveillés en permanence en temps réel pendant plusieurs jours. Le protocole que nous suivons pour la culture des tissus et l&#39;enregistrement de bioluminescence en temps réel a été minutieusement décrites par Yamazaki et Takahashi 11.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

La procédure de préparation des tranches contenant les souris adulte hypothalamique suprachiasmatique noyau (SCN), et un moyen rapide de la culture des tissus SCN dans un état de culture organotypique, sont rapportés. En outre, la mesure de l&#39;expression de la protéine horloge oscillatoires gènes en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase est décrite.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.9K vues.  Karolinska Institutet. La procédure de préparation des tranches contenant les souris adulte hypothalamique suprachiasmatique noyau (SCN), et un moyen rapide de la culture des tissus SCN dans un état de culture organotypique, sont rapportés. En outre, la mesure de l'expression de la protéine horloge oscillatoires gènes en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase est décrite.