FONCICyT 000000000091984;; die Grundlagen der Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist und Sigurd och Elsa Diese Arbeit wurde von der schwedischen Medical Research Council (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3) finanziert Goljes Minne und schwedischen Society of Medicine SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, ist dankbar für die wertvollen Hinweise zum Manuskript anerkannt. Wir danken Dr. Michael Andäng und Dr. Helena Johard für die HCN-Kanal-Blocker, und Prof. Abdel El-Manira für die Bereitstellung von Video-Mikroskop. Ethische Überlegungen: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Karolinska Institutet und &quot;Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot; set durchgeführt. Alle Tierversuche werden mit der Absicht durchgeführt, um mögliche Belastungen oder Unbehagen, das Tier zu minimieren.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. 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Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. 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Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

Vorteile und Nachteile, die mit Luciferase-Reporter-Technologie Im Gegensatz zur Ex-vivo-Methoden, wie z. B. RT-PCR, in situ Hybridisierung und Western-Blot, dass Gewebeentnahme erfordert an vielen verschiedenen Zeitpunkten (was zu einem geringen zeitlichen Auflösung von in der Regel 2-4 Stunden je nach Sampling-Frequenz), um tägliche Studie Variationen in der Gen-und Protein-Ausdrücke erlaubt die Luciferase-Reporter-Technologie mit hoher Auflösung (1-10 min) Studien der circadianen Oszillationen für viele Tage in der gleichen Weise vor. So ist die Zahl der verwendeten Tiere auf ein Minimum reduziert und detaillierte Untersuchungen der Auswirkungen auf Phase und Zeit der Rhythmus sind möglich, was normalerweise nicht möglich ist mit konventionellen Sampling-Techniken mit geringer zeitlicher Auflösung. Doch obwohl relative Amplitude Messungen der Rhythmus möglich sind, sollte betont werden, dass Reporter Technologie nicht quantitative und kann daher nicht verwendet werden, um Mengen von transkribierten Gene oder Proteine ​​übersetzt messen werden. Das Gewebe Aufnahmen gestartet und ausgewertet werden sofort nach der Kultivierung, ein großer Vorteil für das direkte Studium der molekularen Effekte in vivo Stress in vivo lichtinduzierten Phasenverschiebungen etc. Die organotypischen SCN Kultur ermöglicht langfristig (Wochen) pharmakologische Manipulation von erwachsenen Gehirn Gewebe mit einer intakten reifen synaptischen Netzwerk und die Luciferase-Reporter-Technologie ermöglicht eine stabile Aufnahmen für viele Wochen. So macht das Gewebe nicht zu Neugeborenen oder frühen postnatalen werden, um gesunde Kulturen zu erhalten, und im Gegensatz zu den akuten Scheibe chronischen pharmakologischen Behandlungen durchgeführt werden können. Im Gegensatz zu Plasmid-reporter Transfektionen in Zellkulturen, die keine auf den Einbau von DNA in das Genom führen, werden die transgenen Luciferase-Tiermodellen (sowie Lenti-Virus Transfektionen) günstig, wenn epigenetische Veränderungen untersucht werden sollen. Es sollte in diesem Zusammenhang auch erwähnt werden, dass Lumineszenzbildgebung heute ist mit hochempfindlicher CCD-Kameras 11 möglich, so dass Aufnahmen auch in einzelnen SCN Neuronen (~ 6-10 um) und anderen Zelltypen, von den großen Labors Studium zirkadianen Rhythmen genutzt werden. Schließlich mehreren circadianen Ermittler verwenden häufig die Überwachung der molekularen Expression mit anderen Reportern, wie das Green Fluorescent Protein, um Clock-Gen / Protein-Oszillationen 16-19 studieren. Aspekte der Schichtdicke Die hier empfohlenen Dicken der SCN Scheibe (200-300 um) könnte reduziert oder erhöht werden, falls gewünscht. Doch obwohl das Gewebe verflacht auf der Membran nach ein paar Tagen in Kultur, ist es nicht empfehlenswert, 500 pm Dicke der zunächst Anschnitt überschreiten, um die Lebensfähigkeit der Gewebe 7 zu erhalten. Ein Stück dünner als 100 pm ist der Maschinen-und praktischen Gründen schwierig zu handhaben. Da der SCN Gewebe ist heterogen die Dicke der Scheibe kann die Phase der Luciferase Ausgangssignal auswirken, da die verschiedenen Regionen innerhalb des SCN (zum Beispiel den &quot;Kern&quot; gegenüber der &quot;Schale&quot; und dorsal gegenüber ventralen Regionen) mit unterschiedlichen Phasen oszillieren 20 und differentiell nach Phase re-synchronisieren verschiebt 21. Die Dicke der Scheibe wirkt sich auch auf die Grundlinie der Photonenzahl seit mehr Gewebe gibt eine größere Anzahl von Photonen. Die Amplitude des molekularen Schwingungen können auf diese Weise indirekt von der Größe der Explantation betroffen sein. Aus diesen Gründen sollte die Kontrolle und behandelten Kulturen immer die gleiche Größe, Dicke und mit der gleichen Region des SCN, um in der gleichen Phase und mit gleicher Amplitude schwingen. Die beiden einseitigen Kerne, auf der anderen Seite, in Phase schwingen miteinander und mit ähnlichen Amplituden, solange die Vibratom Schnitt ist horizontal und nicht abgewinkelt (die wiederum abhängig ist, dass die Trennung zwischen Kleinhirn und den beiden Hemisphären Schnitt senkrecht auf die Tischoberfläche). Ein Ermittler, der SCN Kultivierung führt möglicherweise zu, dass SCN Kulturen nicht in Phase schwingen miteinander. Üben und Standardisierung der Slicing-Technik, dh die Scheiben sind immer an der gleichen rostro-kaudal des SCN schneiden, wird das Ergebnis verbessern. Kritische Schritte <ol><li> Sauerstoffversorgung ist kritisch. Weil das Gehirn braucht viel Sauerstoff 22, muss das Aufschneiden Verfahren schnell zu sein (Je näher 3,1-3,10 ist auf ~ 5-6 Minuten desto besser ist es in Ordnung zu halten das Gewebe gesund ist). </li><li> Der SCN ist empfindlich gegen Temperaturschwankungen und mittlere auszutauschen. Der SCN ist temperaturempfindlich und großen Temperaturschwankungen können Phasenverschiebung der Herzschrittmacher und verursachen experimentelle Artefakte 23. Wenn mittel-oder Lösungen ausgetauscht werden oder während eines laufenden Experiments, zum Beispiel bei der Anwendung eines Arzneimittels nach ein paar Tagen in Kultur, mittel-oder solutio hinzugefügtn muss vorgewärmt auf 36-37 ° C (die gleiche Temperatur wie in der Kammer) vor der Zugabe werden. In pharmakologischen Experimenten, die mittel-Austausch beteiligen, ist es wichtig, immer mit konditionierten Zellkulturmedium Arbeit. Addition / Wash-out mit frischen, können unbedingte Medium potentiell Phasenverschiebung der molekularen SCN Rhythmus 24 sowie anderen Zelltyp Kulturen 25. </li><li> Medium Zusammensetzung. Es ist wichtig, die Kultur des Gewebes in der richtigen pH-Wert und Osmolalität. Die Luft-Buffering Medium enthält eine große Menge von HEPES, die eine optimale Pufferkapazität im Bereich von pH 6,8 bis 8,2 hat und eignet sich auch für die Pufferung der pH-Änderungen, die als Folge der Zellatmung entstehen können. HEPES, auf der anderen Seite, ist empfindlicher auf Temperaturänderungen als mit Natriumbicarbonat, die in kleinen Mengen in das Kulturmedium enthalten ist verglichen. Natriumbicarbonat hat eine größere Pufferkapazität in den unteren pH-Wert (5,1-7,1)-Bereich 26, also gegebenenfalls in einem CO 2-Atmosphäre. Allerdings erhöhte Mengen von Natriumbicarbonat in der Luft-Buffering Medium (DMEM 2902) erhöht sich die Osmolalität erheblich und kann nicht ohne gleichzeitig Verdünnung des Mediums, was wiederum in die falsche Zusammensetzung der Aminosäuren, Vitaminen und Ionen. Hinzugefügt werden Beratung für die Vorbereitung des Mediums: <ol><li> Seien Sie präzise und vorsichtig beim Mischen des Mediums. </li><li> Verwenden Sie nur frisches oder frisch aufgetaut Stammlösungen. </li><li> Bei sehr hohen Osmolalität ist es nicht wert, Verdünnung. Mehr als 5-6% verdünnten Medium wird wahrscheinlich nicht funktionieren. Verwenden Sie D-Glucose zu Osmolalität erhöhen, wenn sie zu niedrig ist. </li></ol></li><li> Phasenverschiebungen aufgrund Vorbereitungszeit Die Zeit der Scheibe ist von kritischer Bedeutung. Null oder nur minimale Auswirkungen auf Phase ist erreicht, wenn die Scheibe Verfahren zwischen ZT 06-12 Dezember durchgeführt wird. Alle Scheiben Dissektionen sollte bei der gleichen Phase des tageszeitlichen oder circadianen Zyklus durchgeführt werden, um Fehler aufgrund von Abweichungen zwischen der Vorbereitungsphase zu minimieren. </li></ol> Mögliche Änderungen <ol><li> Bei akuten SCN Elektrophysiologie, hat das Schneiden mit einem Ringer (Artificial Cerebro Rückenmarksflüssigkeit; ACSF) durchgeführt werden Puffer, mit Sauerstoff (95% O 2, 5% CO 2) vor dem Schneiden beginnt gesättigt. Darüber hinaus braucht Sauerstoff, kontinuierlich in den Puffer hinzugefügt werden während der gesamten Slicing Verfahren, wie die Elektro-und synaptische Aktivität ist direkt abhängig von Sauerstoff-Versorgung 22. </li><li> Horizontal und sagittalen Schnitten können auch erfolgreich vorbereitet und kultivierten des SCN. Die Autoren haben Erfahrung mit Luciferase-Aufnahmen in horizontale Schnitte, die nach unseren Erfahrungen geben circadianen Oszillationen mit niedriger Amplitude, wie mit dem koronalen Schnitt verglichen. </li><li> Der SCN ist etwa 1 mm langen rostro-kaudal und das Schneiden hier beschriebene Technik ist auf den Erwerb eines SCN Abschnitt in der zentralen Region ausgerichtet. Allerdings kann mehr als eine SCN Abschnitt von Maus und Ratte Gehirn gewonnen werden, so dass die Untersuchung der circadianen Gen / Protein-Expression in mehr rostral gegen kaudalen Ebenen des SCN Kern. </li><li> Slice-Kulturen von jüngeren Tieren, postnatale Welpen oder auch Embryonen, können ebenfalls hergestellt werden. Bitte beachten Sie, dass das Gehirn und dem Schädel in sehr jungen Welpen sehr weich und empfindlich sind. Darüber hinaus ist der Sehnerv dünn und nicht voll entwickelt. Seien Sie vorsichtig beim Sezieren des Gehirns der Jungtiere, so dass die SCN Region nicht beschädigt wird. Zum Beispiel kann micro Rongeur Werkzeuge nicht verwendet werden, um den Schädel des Jungen Maus geöffnet werden, weil sie zu groß sind. Feine Schere genug sind, um die Weichteile in jungen Welpen geschnitten. </li><li> Das Deckglas auf Kultur hier beschriebene Technik kann auch zum Bild Lumineszenz mit einer CCD-/ EM-CCD-Kamera, auch in einzelnen SCN Neuronen verwendet werden. </li><li> Andere zentrale Nervensystem Regionen und periphere Organgewebe aus transgenen PER2:: LUC Tiere können leicht zu erhalten, kultiviert und im Hinblick auf die molekularen Schwingungen analysiert, wie die PER2:: LUC Ausdruck weiterhin für viele Tage auch oszillieren in einer Reihe anderer Gewebe und Zell-Typen 10. Die meisten dieser peripheren Geweben, zum Beispiel Leber, benötigen keine Membran für das Überleben, sondern werden gezüchtet direkt in das Medium 11 getaucht. Bitte beachten Sie, dass Phasenverschiebung durch Schneiden, Kultivierung und mittlere Austausch kann nicht nach den gleichen Grundsätzen wie bei SCN. </li></ol> Bedeutung In transgenen Mäusen und Ratten-Stämme (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) Luciferase-Enzymaktivität spiegelt Protein oder Genexpression Rhythmen und kann durch Biolumineszenz Aufnahme beurteilt werden. Die Luciferase-generated Biolumineszenz gibt ein schwaches Signal, aber der Hintergrund Lumineszenz ist nahe Null, so dass diese Methode von Vorteil. Darüber hinaus, da die Luciferase-Molekül instabil und schnell abgebaut wird es keinen phOtotoxizität, die während einer langfristigen erregenden Beleuchtung 28 angezeigt werden können. Zusammengenommen ermöglichen diese Eigenschaften dauerhaft Experimente machen die Luciferase-Reporter-Technologie sehr vorteilhaft in circadianen Forschung.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

Eine zentrale circadiane (~ 24 Std.) Uhr koordinierende Tagesrhythmus in Physiologie und Verhalten liegt in der suprachiasmatischen Nukleus (SCN) im vorderen Hypothalamus. Die Uhr ist direkt durch Licht über die Netzhaut und Sehnerv synchronisiert. Circadian Schwingungen werden durch die Interaktion negativen Feedback-Schleifen einer Reihe von sogenannten &quot;Clock-Gene&quot; und ihrer Eiweiss-Produkte, einschließlich der für den Zeitraum (pro-) Gene generiert. Die Core-Taktfrequenz ist auch abhängig von Membrandepolarisation, Kalzium und cAMP 1. Der SCN zeigt täglichen Schwankungen in Takt Genexpression, Stoffwechsel und spontane elektrische Aktivität. Bemerkenswert ist, besteht diese endogene zyklische Aktivität in adulten Geweben Scheiben des SCN 2-4. Auf diese Weise kann die biologische Uhr einfach in vitro untersucht werden, so dass molekulare, elektrophysiologischen und metabolischen Untersuchungen der Schrittmacherfunktion. Der SCN ist eine kleine, gut definierte bilaterale Struktur direkt über dem Chiasma 5 befindet. In der Ratte enthält ~ 8.000 Neuronen in jeder Kern und hat Abmessungen von ca. 947 mu m (Länge, rostrokaudalen Achse) x 424 um (Breite) x 390 um (Höhe) 6. Um sezieren die SCN ist es notwendig, einen Hirnschnitt auf der jeweiligen Ebene des Gehirns, wo die SCN identifiziert werden können geschnitten. Hier beschreiben wir die Zerlegung und Slicing Verfahren des SCN, die ähnlich für Maus und Ratte Gehirn ist. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Kultur der sezierten Gewebes organotypically auf einer Membran 7, eine Technik für die SCN Gewebekultur von Yamazaki et al. 8. Schließlich zeigen wir, wie transgene Gewebe zur Messung Ausdruck der Uhren-Gene / Proteine ​​mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie, einer Methode, die ursprünglich für circadiane Messungen Geusz et al verwendet wurde. 9 verwendet werden kann. Wir verwenden hier SCN Gewebe aus den transgenen Knock-in Periode2: LUCIFERASE Mäusen durch Yoo et al 10.. Die Mäuse enthalten ein Fusionsprotein aus PERIOD (PER) 2 und die Glühwürmchen-Enzym Luciferase. Wenn PER2 in der Gegenwart des Substrats für die Luciferase, dh Luciferin übersetzt wird, kann die PER2 Ausdruck als Biolumineszenz überwacht werden, wenn Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin. Die Anzahl der emittierten Photonen positiv korreliert mit der Menge des produzierten PER2 Protein, und die Biolumineszenz-Rhythmen passen die PER2 Protein Rhythmus in vivo 10. Auf diese Weise den zyklischen Schwankungen in PER2 Ausdruck kann kontinuierlich überwacht werden Echtzeit während viele Tage. Das Protokoll folgen wir für Gewebekulturen und real-time Biolumineszenz Aufnahme wurde eingehend von Yamazaki und Takahashi 11 beschrieben.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Das Verfahren zur Herstellung von Scheiben mit der adulten Maus Hypothalamus suprachiasmatischen Nukleus (SCN), und einen schnellen Weg zur Kultur der SCN Gewebe in organotypischen Kultur Zustand, gemeldet werden. Darüber hinaus ist die Messung der oszillatorischen Uhr-Gen-Protein-Expression mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie beschrieben.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.0K Aufrufe.  Karolinska Institutet. Das Verfahren zur Herstellung von Scheiben mit der adulten Maus Hypothalamus suprachiasmatischen Nukleus (SCN), und einen schnellen Weg zur Kultur der SCN Gewebe in organotypischen Kultur Zustand, gemeldet werden. Darüber hinaus ist die Messung der oszillatorischen Uhr-Gen-Protein-Expression mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie beschrieben.

Serie: Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Aufnahme und Analyse der zirkadianen Rhythmen in Laufen-Rad-Aktivität in Nagetiere

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.