Este trabalho foi financiado pelo sueco Medical Research Council (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984, os fundamentos dos Jeansson, Königska Söderström sjukhemmet, Lundqvist Marta e och Sigurd Elsa Goljes Minne e Sociedade Sueca de Medicina SLS-95151. Professor D. Gene Block, UCLA, é reconhecido agradecimento pelos comentários valiosos sobre o manuscrito. Agradecemos ao Dr. Michael Andäng e Dr Helena Johard para o bloqueador dos canais de HCN, e Prof Abdel El-Manira para a prestação de vídeo-microscópio. Considerações éticas: Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Karolinska Institutet e &quot;de Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Todos os experimentos com animais são realizadas com a intenção de minimizar qualquer possível estresse ou desconforto ao animal.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. 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J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker.">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li><li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+clock+nucleus:+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light.">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li><li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization.">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li><li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vantagens e desvantagens com a tecnologia repórter luciferase Em contraste com métodos ex vivo, como RT-PCR, hibridização in situ e Western blot que exigem amostras de tecido em muitos momentos diferentes (dando um tempo de resolução baixa, normalmente de 2-4 horas dependendo da freqüência de amostragem) a fim de estudar diurna variações na expressão dos genes e proteínas, a tecnologia permite que o repórter luciferase de alta resolução (1-10 min) estudos de oscilações circadiano por muitos dias na mesma preparação. Estudos, assim, o número de animais utilizados é minimizado e detalhada dos efeitos sobre a fase e período do ritmo são viáveis, o que normalmente não é possível usar técnicas de amostragem convencional, com tempo de resolução baixa. No entanto, embora as medidas de amplitude relativa do ritmo são possíveis, deve ser enfatizado que a tecnologia repórter não é quantitativa e não pode, portanto, ser utilizada para medir quantidades de genes transcritos ou traduzidos proteínas. As gravações do tecido pode ser iniciado e analisadas imediatamente após o cultivo, uma grande vantagem para estudar diretamente os efeitos do estresse molecular da vivo, em turnos vivo induzida pela luz fase etc A cultura SCN organotípicas permite a manipulação de longo prazo (semanas) farmacológica do cérebro adulto tecido que contém uma rede madura intacta sináptica ea tecnologia repórter luciferase permite gravações estáveis ​​durante muitas semanas. Assim, o tecido não precisa ser pós-neonatal ou cedo, a fim de obter culturas saudáveis, e em contraste com a aguda crônica fatia tratamentos farmacológicos pode ser realizada. Em contraste com o repórter-plasmídeo transfections em culturas de células, o que não fazer levar a incorporação de DNA no genoma, os transgênicos luciferase-modelos animais (bem como lenti-vírus transfections) são favoráveis ​​se alterações epigenéticas estão a ser estudado. Deve, neste contexto, ser mencionado que a imagem de luminescência é hoje possível com câmeras de alta sensibilidade CCD 11, permitindo gravações mesmo em neurônios SCN única (~ 6-10 mm) e outros tipos de células, utilizado por grandes laboratórios estudando ritmos circadianos. Finalmente, vários investigadores circadianos usam geralmente monitoramento de expressão molecular utilizando outros repórteres, como a Proteína Fluorescente Verde, a fim de estudar gene clock / oscilações de proteína 16-19. Aspectos de espessura de corte A espessura recomendada aqui da fatia SCN (200-300 mm) pode ser reduzido ou aumentado, se desejar. No entanto, embora o tecido aplaina para fora da membrana depois de alguns dias em cultura, não é recomendável exceder 500 mM espessura da fatia cortada inicialmente, a fim de preservar a viabilidade do tecido 7. A fatia mais fina do que 100 mm é de razões mecânicas e prática difícil de lidar. Porque o tecido SCN é heterogênea a espessura da fatia pode afetar a fase do sinal de saída luciferase, uma vez que diferentes regiões dentro do SCN (por exemplo, o &quot;core&quot; versus o &quot;shell&quot;, e as regiões dorsal contra ventral) oscilam com diferentes fases 20 e diferencialmente re-sincronizar após a fase de mudanças 21. A espessura da fatia também afeta a linha de base de contagem de fótons, já que mais tecido emite um número maior de fótons. A amplitude das oscilações moleculares podem desta forma ser indiretamente afetada pelo tamanho do explante. Por estas razões, e controle de culturas tratadas deve ser sempre do mesmo tamanho, espessura e contendo a mesma região do SCN, a fim de oscilar na mesma fase e com a mesma amplitude. Os dois núcleos unilateral, por outro lado, oscilam em fase uns com os outros e com amplitudes semelhantes, desde que o corte é vibratome horizontal e não em ângulo (que por sua vez é dependente de que a separação entre corte cerebelo e os dois hemisférios é perpendicular para a superfície da mesa). Um investigador que realiza cultura SCN pode experimentar que as culturas SCN não oscilam em fase uns com os outros. Praticando e padronização da técnica de fatiamento, ou seja, as fatias são sempre cortadas no nível do rostro-caudal mesma do SCN, vai melhorar o resultado. Etapas críticas <ol><li> Suprimento de oxigênio é fundamental. Porque o cérebro requer uma grande quantidade de oxigênio 22, o procedimento de corte precisa ser rápido (Quanto mais próximo 3,1-3,10 é ~ 5-6 minutos o que é melhor para manter os tecidos saudáveis). </li><li> O SCN é sensível às mudanças de temperatura e troca de meio. O SCN é sensível à temperatura e mudanças de temperatura grandes podem mudar a fase de pacemaker e causar artefatos experimentais 23. Se médio ou soluções sejam trocados ou adicionados durante um experimento em andamento, por exemplo, quando a aplicação de uma droga depois de alguns dias em cultura, o meio ou solution precisa ser pré-aquecido a 36-37 ° C (a mesma temperatura na câmara) antes da adição. Em experimentos farmacológicos que envolvem meio de intercâmbios, é importante sempre trabalhar com pré-condicionados meio de cultura celular. Adição / wash-out com frescos, médio incondicionado pode, potencialmente, de mudança de fase do ritmo SCN molecular 24, assim como outras culturas de células de tipo 25. </li><li> Composição do meio. É importante para a cultura do tecido no pH correto e osmolalidade. O meio de ar-buffering contém uma grande quantidade de HEPES, que tem uma ótima capacidade tampão na faixa de pH 6,8-8,2 e também é adequado para o armazenamento temporário de mudanças de pH que podem ocorrer como resultado da respiração celular. HEPES, por outro lado, é mais sensível às mudanças de temperatura em comparação com bicarbonato de sódio, que está incluído em pequenas quantidades no meio de cultura. Bicarbonato de sódio tem uma maior capacidade de buffer no baixo pH (5,1-7,1) Gama 26, portanto, apropriado em uma atmosfera de CO 2. No entanto, aumento da quantidade de bicarbonato de sódio no meio ar-buffering (DMEM 2902) aumenta significativamente a osmolalidade e não podem ser adicionados sem, simultaneamente, diluindo o meio, que por sua vez resulta na composição incorreta de aminoácidos, vitaminas e íons. Conselhos para preparar o meio de: <ol><li> Ser preciso e cuidadoso ao misturar o meio. </li><li> Use soluções estoque fresco ou recém-descongelado. </li><li> Em caso de osmolalidade muito alto não vale a pena diluindo. Mais do que 5-6% de diluição média muito provavelmente não funcionar. Use D-glicose para aumentar a osmolalidade se for muito baixa. </li></ol></li><li> Fase de mudanças devido ao tempo de preparação O tempo de preparação fatia é crítica. Efeito zero ou mínimo na fase é obtido se o procedimento de corte é realizada entre ZT dezembro 06-12. Todos dissecações fatia deve ser realizada na mesma fase do ciclo diurno ou circadiano, a fim de minimizar o erro devido à fase de variação entre as preparações. </li></ol> Possíveis modificações <ol><li> Para eletrofisiologia SCN aguda, o corte tem que ser realizada com uma campainha (Fluid Cerebro Artificial Spinal; ACSF) buffer, saturada com oxigênio (95% O 2, 5% de CO 2) antes do início do corte. Além disso, o oxigênio precisa ser adicionados continuamente ao buffer durante todo o procedimento de corte, como a atividade elétrica e sináptica está diretamente dependentes do fornecimento de oxigênio 22. </li><li> Fatias horizontais e sagital também pode ser preparado com êxito e culta do SCN. Os autores têm experiência com gravações luciferase em fatias horizontais, que de acordo com nossa experiência dar oscilações circadiano com menor amplitude, em comparação com o corte coronal. </li><li> O SCN é de aproximadamente 1 mm de comprimento rostro-caudal e da técnica de corte descrito aqui é voltado para a aquisição de uma seção SCN na região central. No entanto, mais de uma seção SCN pode ser obtido a partir do rato e cérebro de ratos, permitindo a investigação da expressão do gene / proteína circadiano em níveis mais rostral contra caudal do núcleo SCN. </li><li> Culturas fatia de animais mais jovens, os filhotes ou mesmo pós-natal de embriões, também pode ser preparado. Por favor, note que o cérebro eo crânio em filhotes muito jovens são muito macios e sensíveis. Além disso, o nervo óptico é fino e não completamente desenvolvidos. Tome cuidado ao dissecar o cérebro dos filhotes para que a região SCN não está danificado. Por exemplo, ferramentas de micro rongeur não pode ser usado para abrir o crânio de filhotes de rato, porque eles são grandes demais. Tesouras finas são o suficiente para cortar os tecidos moles em filhotes jovens. </li><li> A tampa de vidro técnica de cultura baseada descrito aqui também pode ser usado para luminescência imagem utilizando uma câmera CCD / EM-CCD, também em neurônios SCN único. </li><li> Outras regiões do sistema nervoso central, e os tecidos de órgãos periféricos de transgênicos PER2:: LUC animais pode ser facilmente obtida, culta e analisados ​​em termos de oscilações molecular, como o PER2:: LUC expressão continua a oscilar durante muitos dias também em uma série de outros tecidos e tipos de células 10. A maioria destes tecidos periféricos, por exemplo, o fígado, não precisam de uma membrana para a sobrevivência mas são cultivadas diretamente banhado em 11 médias. Por favor note que, devido à mudança de fase de corte, cultura e troca de mídia não pode seguir os mesmos princípios para SCN. </li></ol> Significado Em camundongos transgênicos e cepas de ratos (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) atividade da enzima luciferase reflete proteína ou ritmos expressão dos genes e pode ser avaliada através da gravação de bioluminescência. A bioluminescência luciferase gerado dá um sinal fraco, mas a luminescência de fundo está perto de zero, tornando este método vantajosa. Além disso, porque a molécula luciferase é instável e rapidamente degradada não há phototoxicidade, que podem aparecer durante a longo prazo iluminação excitatórios 28. Juntas, essas propriedades permitem experimentos de longa duração tornando a tecnologia repórter luciferase altamente vantajoso em pesquisa circadiano.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

A central de relógio (~ 24 h) circadiano coordenação ritmos diários na fisiologia e comportamento reside no núcleo supraquiasmático (SCN), localizado no hipotálamo anterior. O relógio está diretamente sincronizada com a luz através da retina e nervo óptico. Oscilações circadiano são geradas pela interação loops de feedback negativo de um número dos chamados &quot;genes do relógio&quot; e seus produtos protéicos, incluindo o período (por) genes. O clock do núcleo também é dependente despolarização da membrana, cálcio e cAMP 1. O SCN apresenta oscilações diárias na expressão dos genes, atividade metabólica e atividade elétrica espontânea. Notavelmente, esta atividade cíclica endógena persiste em fatias de tecido adulto do SCN 2-4. Desta forma, o relógio biológico pode facilmente ser estudados in vitro, permitindo investigação molecular, eletrofisiológica e metabólicas da função marca-passo. O SCN é uma pequena estrutura bem definida bilateral localizada logo acima do quiasma óptico 5. No rato que ele contém ~ 8,000 neurônios em cada núcleo e tem dimensões de cerca de 947 mM (eixo de comprimento, rostrocaudal) x 424 M (largura) x 390 M (altura) 6. Para dissecar o SCN é necessário cortar uma fatia do cérebro ao nível específico do cérebro onde o SCN podem ser identificadas. Aqui, descrevemos o processo de dissecação e corte do SCN, que é semelhante para o rato e cérebro de ratos. Além disso, mostramos como a cultura de tecidos dissecados organotypically em uma membrana 7, uma técnica desenvolvida para a cultura de tecidos SCN por Yamazaki et al. 8. Finalmente, demonstrar como tecidos transgênicos podem ser usados ​​para medir a expressão de genes relógio / proteínas usando a tecnologia dinâmico repórter luciferase, um método que originalmente era usado para as medições circadiano por Geusz et al. 9. Nós aqui usam tecidos SCN da transgênicos knock-in período2:: ratos luciferase produzido por Yoo et al 10.. Os ratos contêm uma proteína de fusão do período (PER) 2 ea luciferase enzima vaga-lumes. Quando PER2 se traduz na presença do substrato para a luciferase, ou seja, a luciferina, a expressão PER2 podem ser monitorados como bioluminescência quando luciferase catalisa a oxidação da luciferina. O número de fótons emitidos positivamente correlacionada com a quantidade de proteína produzida PER2, e os ritmos bioluminescência corresponder ao ritmo de proteínas PER2 in vivo 10. Desta forma, a variação cíclica na expressão PER2 pode ser continuamente monitorado em tempo real durante muitos dias. O protocolo que seguimos para cultura de tecidos e gravação em tempo real bioluminescência tem sido exaustivamente descrita por Yamazaki e Takahashi 11.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

O processo de preparação de fatias contendo o adulto do rato hipotálamo núcleo supraquiasmático (SCN), e uma maneira rápida para a cultura do tecido SCN em condições organotípicas cultura, são relatados. Além disso, a medição da oscilação expressão da proteína do gene do relógio usando a tecnologia dinâmico repórter luciferase é descrito.

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

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Neuroscience

34.9K visualizações.  Karolinska Institutet. O processo de preparação de fatias contendo o adulto do rato hipotálamo núcleo supraquiasmático (SCN), e uma maneira rápida para a cultura do tecido SCN em condições organotípicas cultura, são relatados. Além disso, a medição da oscilação expressão da proteína do gene do relógio usando a tecnologia dinâmico repórter luciferase é descrito.