وقد تم تمويل هذا العمل في أجزاء من المنح والمعاهد الوطنية للصحة GM073197 RR025336.

ويظهر مخطط نموذجي لفي بلورة التجربة في المتوسط ​​1،2 Fig.1. قبل بلورة LCP - FRAP المقايسات اختيارية ، إلا أنها يمكن أن يسرع بشكل كبير من عملية البحث عن بلورة شروط الأولية ، وخاصة في حالة صعبة للبروتينات غشاء 3. 1. إعادة تشكيل البروتين في LCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البروتين غشاء مصلحة في التوصل إلى حل المنظفات وتركيز مجمعات البروتين / المنظفات ل~ 10 -- 20 ملغ / مل ، مع الحرص على عدم المبالغة في التركيز على 1،4 المنظفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ نقل 25 ميلي غرام من الدهون LCP المضيفة (عادة monoolein) أو خليط الدهن إلى أنبوب من البلاستيك 1.5 مل واحتضانها في 40 درجة مئوية لعدة دقائق حتى تذوب الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق مقرنة حقنة لحقنة 100 ميكرولتر الغاز محكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل المحاقن مع الدهن المنصهر باستخدام ماصة حجم قابل للتعديل. سجل حجم الدهون في حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل آخر حقنة 100 ميكرولتر مع الحل القائم على البروتين بنسبة الحل إلى البروتين الدهني 03/02 ت / V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال سواء عن طريق الحقن معا مقرنة المحاقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع الغطاسون حقنة بالتناوب لتحريك الدهون والبروتينات من خلال إبرة الداخلية للمقرنة ، ذهابا وإيابا ، حتى تصبح متجانسة mesophase الدهون. LCP الأشكال تلقائيا عند الخلط الميكانيكي ، ويصبح البروتين في تشكيل طبقة ثنائية الدهن من نظام الإجراءات الجزائية. ويمكن التحقق منها عن طريق تكوين LCP اتساقه وشفافة مثل الهلام ، وبسبب غياب birefringency عند عرضها تحت المجهر مجهزة عبر المستقطبات ، أو ، إذا كان ذلك ممكنا ، وذلك باستخدام الصغيرة زاوية حيود الأشعة السينية 1. </li></ol> 2. LCP - FRAP فحوصات ما قبل تبلور صممت LCP - FRAP المقايسات لقياس الخصائص نشر بروتينات غشاء تشكيلها في LCP في مجموعة متنوعة من الظروف الفرز 3. نشر طويلة المدى للبروتينات غشاء في LCP ضروري لبلورة ناجحة ، إلا أن المجهرية من LCP تقيد نشر أو مجاميع كبيرة من البروتينات البروتين oligomeric. وثمة سبب شائع للفشل في تجربة لبلورة المتوسط ​​هو تجميع البروتين سريع مما يؤدي إلى فقدان نشرها. وقد تبين أن سلوك التجميع من البروتين يعتمد على بناء بروتين معين ، والدهون وتكوين المضيف من الحل الفرز 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية البروتين مع صبغة الفلورسنت (Cy3 أو ما شابه) في نسبة البروتين / صبغ ~ 100 / 1 ، إزالة الصبغة المتفاعل وتركيز البروتين ل~ 1 ملغ / مل. تسمية الأمينات إما مجانا أو thiols الحرة. عندما وضع العلامات الأمينات الحر ، استخدم الرقم الهيدروجيني بين 7 و 7.5 لتسمية يغلب الحرة N - محطة. أن تدرك أن وضع العلامات الأمينية يمكن أيضا تسمية الدهون المشترك مع البروتين النقي 2،3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل البروتين المسمى في LCP كما هو موضح في القسم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات الفحص كما هو موضح في القسم 3) باستخدام حلول الفرز LCP - FRAP بدلا من الشاشات تبلور 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة 12 ساعة على الأقل لتحقيق حالة التوازن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد من لوحات على محطة LCP - FRAP والتركيز على أول بئر باستخدام الهدف 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 الحصول على صور الفلورسنت لالتقاط الأولية قبل المبيضة الدولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الليزر. ينبغي تعديل قوة الليزر وعدد من البقول لتبييض ~ 30 -- 70 ٪ من البروتين المسمى في وسط البقعة المبيضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التسبب في الليزر ، وبدء تسجيل سريع بعد سلسلة من الصور تبيض 200 ~ بمعدل أسرع وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع مع تسجيل تسلسل بعد التبييض بطيئة من الصور ~ 50 ، واختيار الصور والتأخير بين 10-20 ثانية ، اعتمادا على معدل الانتشار من البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدماج كثافة داخل بقعة التبييض في جميع الأطر وتصحيحها للتبييض وشدة ضوء التقلبات خلال اقتناء بقسمة كثافة داخل بقعة المبيضة التي بلغ متوسط ​​كثافة بقعة مرجعية من خارج المنطقة ليزر ابيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع كثافة تصحيح لجعل كثافة قبل المبيضة يساوي 1 وكثافة الأولي ابيض يساوي 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب منحنى كثافة مقابل تطبيع الوقت ، F (ر) ، وذلك باستخدام المعادلة التالية : 5 ف (ر) س = M إكسب (- 2T / ر) × (I 0 (2T / ر) + I 1 (2T / طن)) ، (Eq.1) حيث M هو جزء من الجزيئات المتحركة نشرها ، تي هي المرة نشر مميزة ، t هو الوقت الحقيقي من كل إطار مسجل ، 0 أنا وأنا هي السابعة 1 0 و 1 ش أجل تعديل وظائف بسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معامل الانتشار ، D ، على النحو التالي : D = R / 2 4T ، (Eq.2) حيث R هو نصف قطرها من بقعة المبيضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل رس البئر المقبل ، وكرر الخطوات من 2.5) -- 2.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة الكسور المحمول ومعاملات الحصول على نشرها لظروف مختلفة الفرز. تصميم شاشات جديدة تبلور على أساس المكونات التي سهلت انتشار البروتين والشروط باستثناء التي لم يكن لوحظ انتشار البروتين. إذا لم البروتين المنتشر في أي من الشروط فرزهم ، والنظر في توسيع مساحة الفرز أو محاولة بناء البروتين الجديد. </li></ol> 3. إعداد المحاكمات البلورة LCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل البروتين في LCP كما هو موضح في القسم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل LCP البروتين لادن الى 10 حقنة الغاز محكم ميكرولتر تعلق على موزع حقنة المتكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق إبرة قصيرة القابلة للإزالة (قياس 26 و 10 ملم طول) لحقنة في 10 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 200 من نظام الإجراءات الجزائية boluses NL على سطح أربع آبار مجاورة تشكيل مربع 2X2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب كل من boluses LCP مع 1 ميكرولتر من المقابلة بلورة حل الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتويج أربع آبار تحميل مع ساترة 18 مم مربع من الزجاج. تطبيق ضغط لطيف على ساترة لاغلاق الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.4) -3.6) مع مجموعة من 4 آبار المقبل حتى يتم شغلها لوحة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في درجة حرارة ثابتة ، والتحقق بصفة دورية لتشكيل الكريستال والنمو. </li></ol> 4. حصاد بلورات من LCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة مع البلورات البروتينية تحت المجهر ستيريو مع تقريب متغير ، مجهزة المستقطب الخطي الدورية ومحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كذلك التركيز على الاهتمام باستخدام الطاقة المنخفضة التكبير بحيث يتم وضع البئر كله داخل مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل الزجاج ساترة في أربع ضربات صنع مربع داخل حدود جيدا باستخدام زاوية حادة لقطع الحجر الشعرية السيراميك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة حول محيط احرز مع ملاقط حاد نقطة قوية لنشر الخدوش من خلال سماكة الزجاج ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة اثنين من الثقوب الصغيرة في زوايا عكس مربع وسجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ميكرولتر قليل من حل مرسب من خلال واحدة من الثقوب للحد من الجفاف خلال الخطوات اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة حادة الزاوية التحقيق كسر الزجاج على طول واحد أو وجهين لتحرير مربع خفض التدريجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بعناية لمشاهدة مربع من الزجاج لبلعة المرحلة مكعب. إذا عالق البلعة إلى ساترة ، والوجه ثم مربع من الزجاج وأكثر من مكان في قاع البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر اضافية قليلة من حل مرسب ، على أن تستكمل مع البرد حاصن ، إذا لزم الأمر ، على رأس مكعب بلعة المرحلة التي تتعرض لها من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة التكبير للمجهر والتركيز على وضوح الشمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الزاوية بين المستقطب ومحلل لزيادة التباين بين الكريستال مزدوج الانكسارية والخلفية ، مع الحفاظ على ما يكفي من الضوء لرؤية حلقة الحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد MicroMount MiTeGen بقطر مطابقة حجم الكريستال والبلور ثم الحصاد مباشرة من نظام الإجراءات الجزائية التي تجريف عليه في MicroMount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلاش تجميد MicroMount مع الكريستال المقطوع في النيتروجين السائل ، وشحنه إلى beamline مصدر السنكروتروني لجمع البيانات بالأشعة السينية 6. </li></ol> 5. ممثل النتائج : وأعربت عن تصميمها الإنسان بيتا 2 الأدرينالية G مستقبلات البروتين يقترن (AR - 2 β T4L) في الفيروسة العصوية المصابة sf9 خلايا الحشرات وتنقيتها في dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinate (CHS) حل المنظفات منضمة إلى ناهض معكوس a جزئية carazolol 7. وكان المسمى البروتين مع استر NHS Cy3 واستخدامها في فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP (الشكل 2). تنتج شاشات الشبكة الخشنة على أساس عدة شروط المحددة من نتائج LCP - FRAP المقايسات المبدئية الكريستال مثل يضرب (الشكل 3). أثمرت مزيد من التحسين ظروف مرسب بلورات نوعية حيود (الشكل 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التدفق بيانيا من تجربة نموذجية LCP التبلور. لا وصف الخطوات في مربعات رمادية في البروتوكولات الحالية. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. LCP - FRAP مقايسة مع AR-T4L/carazolol 2 β LCP monoolein في مقرها. أ) من نتائج الفحص LCP - FRAP يؤديها في وضع الإنتاجية العالية التلقائي ، والتي هي عينة من المبيض كل لوحة 96 - جيدا بالتسلسل ويقاس مضان الانتعاش بعد حضانة و 30 دقيقة. يتم رسم الحصول على المبالغ المستردة مضان ، والتي تمثل جزء الهاتف النقال في كل عينة ، لجميع العينات 96. الحلول الفرز تحتوي على 0.1 درجة الحموضة M تريس 8 ، 30 ٪ V / V PEG 400 مجتمعة مع 48 أملاح مختلفة في اثنين من تركيزات مختلفة. B) ملامح الانتعاش الإسفار عن مندوب عدةresentative شروطه. منحنيات الخط الصلبة التي تمثل المعادل تناسبها. ويتم تحديد الكسور 1.The المحمول ونشرها باستخدام معاملات EQS. 1 و 2. انتعاش سريع من أقل من 10 ٪ في العينة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم ومن المقرر أن الدهون fluorescently المسمى التعاون مع البروتين النقي. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. مشاهدات الكريستال الأولية AR-T4L/carazolol 2 β التي حصلت عليها لفحص الشبكة الخشن حول الشروط التي حددها الواعدة LCP - FRAP ، تحتوي على سلفات الصوديوم (لوحة أ) و نا فورمات (لوحة باء). يسمى البروتين مع استر NHS Cy3 وتؤخذ الصور الفلورسنت باستخدام الإثارة في 543 نانومتر ، والانبعاث في 605 نانومتر. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. بلورات الأمثل من AR-T4L/carazolol 2 β. تؤخذ الصور من بلورات نمت في وجود كبريتات الصوديوم (لوحات A و B) وK فورمات (لوحات C و D) في وضع brightfield (لوحات A و C) ، وعبر استخدام المستقطبات (لوحات وباء ودال).

<ol>
	<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li><li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization.">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li><li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein:+implications+for+membrane+protein+crystallization.">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li><li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments.">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li><li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam.">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases.">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization.">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+screens:+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins.">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

البروتوكولات توفير التوجيه البصري الأساسية للخطوات الرئيسية التي تشارك في أداء التجارب في التبلور المتوسط. أكثر تعمقا في التفاصيل المتعلقة بهذه البروتوكولات ، والتأكيد على المخاطر المحتملة ، وأوجه القصور أو طرق بديلة متاحة في أماكن أخرى 1،2. يمكن اختياريا LCP - FRAP المقايسات مساعدة في المراحل السابقة لتحديد بناء البروتين الواعدة ، LCP الدهون والمواد المضافة المضيف الدهون ، وكذلك الحد من نطاق ممكن ، والظروف precipitants العازلة 3. حالما يتم العثور على ضرب تبلور الأولية ، ينبغي أن يكون الأمثل من الحصول على بلورات ذات نوعية أفضل. التحسين من المستوى المتوسط ​​في ظروف مشابهة تبلور أساسا إلى تحسين الظروف للبروتينات قابلة للذوبان مع إضافة المزيد من المعلمات المرتبطة تكوين LCP 1. بلورات البروتين غشاء تزرع في mesophase lipidic وعادة ما تكون أصغر في الحجم من الحصول على بلورات في محلول التنظيف ، ولكن أكثر أمر ، وبالتالي يستفيد بشدة من استخدام microfocus beamlines المتاحة في مصادر السنكروتروني الحديثة 6. وقد تم العديد من الإجراءات ذات الصلة في بلورة المتوسط ​​، بما في ذلك إعداد مقايسة لوحات أو التبلور ، وإجراء فحوصات LCP - FRAP وكشف البلورات ، أو شبه آلي بالكامل 1،2،8،9 ، مما يسمح للفحص مجموعة كبيرة من الظروف بينما تستهلك كميات صغيرة من البروتين والدهون. من ناحية أخرى ، reconstitutions البروتين في LCP الكريستال والحصاد لا تزال العمليات اليدوية ومملة أكثر ، وبالتالي يكون هناك حاجة للتحسين.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>100 &mu;L gas-tight syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7656-01</td>
<td>2 syringes are required</td>
</tr>
<tr>
<td>10 &mu;L gas-tight syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7653-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7770-02 30902</td>
<td>The coupler can be made using available parts as described in refs. 10</td>
</tr>
<tr>
<td>Repetitive syringe dispenser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>83700</td>
<td>The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11</td>
</tr>
<tr>
<td>Short (0.375&#x201D;) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7804-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well glass sandwich plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>08 900 03</td>
<td>For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63787-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>monoolein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M7765</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystallization screens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13.</td>
</tr>
<tr>
<td>Capillary cutting stone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton Research</td>
<td>HR4-334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine point tweezers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled sharp probe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>13650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MicroMounts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MiTeGen</td>
<td>M1-Lxx-xx</td>
<td>Select MicroMount diameter to match the crystal size</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

بروتينات غشاء أداء المهام الحرجة في الخلايا الحية المتصلة إشارة تنبيغ والنقل وتحولات الطاقة ، وعلى هذا النحو ، وتورط في العديد من الأعطال والأمراض. ومع ذلك ، فهم الهيكلية والوظيفية للبروتينات غشاء متخلفة بقوة وراء ذلك من شركائها القابلة للذوبان ، أساسا ، بسبب الصعوبات المرتبطة solubilization وجيل من بلورات نوعية الحيود. تبلور في mesophases lipidic (المعروف أيضا باسم الوسيط في بلورة أو LCP) هي تقنية واعدة والتي تم تطبيقها بنجاح للحصول على دقة عالية من البنى rhodopsins الميكروبية ، والبروتينات الضوئي ، الغشاء الخارجي برميل بيتا ومستقبلات البروتين يقترن G. الوسيط في بلورة يستفيد من البيئة الأصلية مثل غشاء وتنتج عادة بلورات مع محتوى أقل من المذيبات وترتيب أفضل بالمقارنة مع بلورة الحلول التقليدية من المنظفات. الطريقة ليست صعبة ، ولكن يتطلب فهم السلوك المرحلة الدهون والممارسة في التعامل مع مواد لزجة mesophase. هنا علينا أن نظهر وسيلة بسيطة وفعالة لجعل نظام الإجراءات الجزائية ، وإعادة تشكيل بروتين في الغشاء الدهني للطبقة ثنائية LCP باستخدام خلاط حقنة ، تليها الاستغناء عن أجزاء من نانولتر LCP إلى مقايسة أو لوحة التبلور ، وإجراء فحوصات ما قبل تبلور والحصاد من بلورات نظام الإجراءات الجزائية المصفوفة. هذه البروتوكولات تقدم دليلا الأساسية للاقتراب من المستوى المتوسط ​​في تجارب التبلور ، ولكن كما هو الحال مع أي تجربة التبلور ، وفحص واسعة والتحسين المطلوبة ، وليس مضمونا بالضرورة إلى نتيجة ناجحة.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases at JoVE.com

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

البروتوكولات وصف الخطوات الضرورية للحصول على بلورات حيود نوعية من البروتين غشاء بدءا من إعادة تشكيل البروتين في مرحلة مكعب lipidic (LCP) ، وإيجاد الظروف الأولية مع فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP ، وإقامة محاكمات تبلور LCP الحصاد والبلورات .

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

crystallization-of-membrane-proteins-in-lipidic-mesophases

Research

JoVE Journal

Biology

31.2K Views.  The Scripps Research Institute. البروتوكولات وصف الخطوات الضرورية للحصول على بلورات حيود نوعية من البروتين غشاء بدءا من إعادة تشكيل البروتين في مرحلة مكعب lipidic (LCP) ، وإيجاد الظروف الأولية مع فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP ، وإقامة محاكمات تبلور LCP الحصاد والبلورات .

Video: Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

تقييم المحاكمات تبلور ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء الصغيرة للدراسات البيولوجيا الهيكلية التي البلوريات الكترون

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...