وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ، الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) ، ومنحة دراسية للتدريب CIHR (لLF). نشكر الأستاذ جيرار دي رايت (جامعة ماكماستر ، كندا) لالجميح للسيارات (6) - II التعبير البلازميد.

1. إعداد الحلول الأسهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية جزيء من الفائدة. (وفي هذه الحالة ، يتم عزل أمينوغليكوزيد - N - 6&#39; أسيتيل - II (AAC6&#39; - II) ، كما ذكرت في مكان آخر. 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 لترات من إعداد العازلة لغسيل الكلى. (في هذه الحالة كنا 25 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، 238.3 ميغاواط ز / مول) ، التي تحتوي على حمض 2 ملي ethylenediaminetetraacetic (EDTA ، 292.2 ميغاواط) ، في الرقم الهيدروجيني 7.5.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze البروتين و(6 &#39;) AAC - II نموذج (5 مل بسعر 400 ميكرومتر) المستخدمة يجب مدال العازلة في غسيل الكلى (3 × 1.3 لتر). يبقى الحل النهائي لشطف الغسيل آلة لتخفيف والعينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح الحل النهائي غسيل الكلى من خلال مرشح ميكرومتر السليلوز 0.45 ، وتخزينها في 4 درجة مئوية. وسوف يشار إليها باسم &quot;تشغيل العازلة&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل تصفية البروتين من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر التي تم تشطف جيدا مع العازلة على التوالي. قياس تركيز النهائي من البروتين باستخدام مقايسة القياسية (برادفورد ، لوري ، الخ) أو الامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية. تخزين البروتين لتحقيق أقصى قدر من الاستقرار على المدى الطويل. (وفي حالة AAC (6 &#39;) ، الجزء الثاني ، وهذا يعني تخزين في 4 درجات مئوية. AAC (6&#39;) - II لا تحتفظ النشاط بعد تجميد والذوبان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 200μL من 25 ملم من محلول المخزون وأنزيم أسيتيل (AcCoA ، ويجند ، 809.57 ميجاوات) عن طريق إذابة 4.0 ملغ في تشغيل العازلة. التجميد في -78 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب على كل من البروتين وعينات يجند حلول تنبع من نفس الرصيد ، للحد من عينة عشوائية العينة إلى التقلبات في التركيز. يتم ضبط عامل واحد لتصحيح تركيز البروتين عبر كامل مجموعة البيانات متغير ج في التحليل. 10 </li></ol> 2. عينات المركز بإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل انزيم إلى القيمة من 64 ج مع الحجم النهائي من 2 مل. (وفي حالة AAC (6 &#39;) - II ، وهذا يتوافق إلى 192 ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة حل يجند الأسهم (AcCoA) في الماء المثلج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.5 مل من محلول AcCoA 10 مرات أكثر تركيزا ثم عدد من المواقع ملزمة للبروتين ، في هذه الحالة 4 ملم ، عن طريق تمييع 80 ميكرولتر من محلول المخزون AcCoA في 420 ميليلتر من تشغيل المخزن المؤقت. نقل في أنبوب ملء ماصة. عودة بسرعة إلى حل الأسهم AcCoA -78 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديغا البروتين والحلول في ظل فراغ لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 1 درجة مئوية تحت درجة حرارة التشغيل المطلوبة (19 درجة مئوية). </li></ol> 3. إعداد الحقنة 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج حقن حقنة حقنة من خلال حامل حتى المشبك حقنة قبل شنت هو على نفس الارتفاع حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية المشبك حقنة الثاني على حقن حقنة حتى يتم الضغط بقوة ضد أسفل حامل المحاقن. تشديد بلطف المشبك مع توفير 0.050 محرك بول &quot;الهيكس نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صاحب مكان الحقنة في حامل ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة بلطف حاقن ماصة في حقنة الحقن. تأكد من تغذية رأس الغطاس مباشرة في حفرة من الحقنة. بمجرد إدراجها بشكل كامل ، المسمار قلادة تأمين صاحب حقنة في حاقن ماصة. </li></ol> 4. تحميل خلية العينة 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلية العينة مع حد أدنى من 50 مل من تشغيل المخزن ، وإزالة أي السائل المتبقية باستخدام طويلة اذعا زجاج 2.5 مل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم ببطء الحد الأدنى من 1.8 مل من محلول البروتين في عينة نظيفة وجافة طويلة اذعا حقنة مل 2.5. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بعناية في الخلية عينة الإبرة واللمس بلطف أسفل الخلية. رفع الطرف قليلا (~ 1 ملم) وحقن بلطف AAC (6 &#39;) - II حل في الخلية حتى السائل الزائد مرئيا فوق الجزء العلوي من الخلية العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع ببطء الإبرة حوالي 1 سم مع ضمان يبقى السائل في تجاوز. الانسحاب بسرعة وحقن كمية صغيرة من محلول (~ 0.25 مل) لإزالة أي فقاعات المحاصرين في خلية العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل تجاوز الحل. ويتم تحقيق هذا عن طريق تحريك الإبرة بلطف جنبا الى جنب مع من تجاوز في الخلية العينة. غيض حقنة سوف تصل على الحافة ، وهذا هو ذروة الرغبة في حل قيد التشغيل. إزالة كافة السائل الذي يجلس فوق هذا الخط. </li></ol> 5. تحميل حقن حقنة والشروع في تشغيل 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق تحميل أنبوب بلاستيكي حقنة بمنفذ التعبئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقل تلميح المكبس إلى أعلى سد المنفذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حل AcCoA في أنبوب ملء ماصة في الجزء السفلي من حامل ماصة. ينبغي للطرف الحقنة عدم لمس الجزء السفلي من أنبوب الملء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم ببطء الحل في حقنة حتى كمية صغيرة يدخل أنبوب المحقنة التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق المنفذ ملء بتخفيض رأس المكبس وانقر على زر إغلاق ميناء التعبئة. تطهير والملء ، وذلك بالنقر على إزالة -&gt; زر تعبئة ، و 3 مرات لإزالة أي فقاعات الهواء التي قد أصبحوا محاصرين أثناء التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب الملء من حامل ماصة ويمسح برفق طرف الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ حقنة ماصة التجمع وأقل برفق داخل الخلية العينة. المضي قدما ببطء والحقنة يمكن ينحني بسهولة ، لذلك هناك حاجة إلى عناية كبيرة. ضمان إدراج تماما الحقنة عن طريق الضغط باستمرار على قاعدة تأمين ذوي الياقات البيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة المطلوبة تعمل (في هذه الحالة 20 درجة مئوية) ، وتحديد مرجعية السلطة التي هي أكبر قليلا من تدفق حقن الحرارة القصوى المتوقعة (في هذه الحالة 20μcal/sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج حقن كميات المطلوبة والتأخير. (وفي هذه الحالة ، تم توظيف 28 عن طريق الحقن. الحقنة الأولى كان حجم 2 ميكرولتر مع تأخير 60 ق. جميع الحقن التي تلت تلك الكميات من 10 ميكرولتر مع التأخير 330 ق.) </li></ol> 6. تشغيل اللاحقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعمل في كل لاحقة كرر الخطوات 2-5 ، بينما تتناقص AAC (6 &#39;) ثانيا ، وتركيزات AcCoA بعامل 2،4،8،16 ، و 32. </li></ol> 7. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإجراء المناسب الذي يناسب العالم كافة الأيسوثرم لمجموعة واحدة من المعلمات ملزم ، كما هو موضح سابقا 10. </li></ol> 8. ممثل النتائج وتظهر بيانات تمثيلية في الشكل 1. وينبغي أن الأشكال من الأيسوثرم تختلف مع التركيز. ومن المتوقع حدة التحولات لأعلى قيم ج (أي أعلى من البروتين وتركيزات يجند) (الشكل 2). في حالة AAC (6 &#39;) ، الجزء الثاني ، نموذج ثنائي موقع متسلسل يعطي أفضل من واحد يصلح اصفا مجموعتين من المواقع ، ومتطابقة مع stoichiometries مستقلة قابلة للتعديل. <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الأيسوثرم المعايرة التي تنتجها من AcCoA (3.86 ملم) في الجميح للسيارات (6 &#39;) - II (192 ميكرومتر). أ) تتبع المركز الخام. ب) القيم المتكاملة المستخدمة لتحديد المعلمات ملزم (المربعات) مع نوبة 2 - موقع متسلسل (--). <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الأيسوثرم مركز التجارة الدولية لAcCoA معاير في الجميح للسيارات (6 &#39;) - II بتركيزات متفاوتة. واحتواء البيانات التجريبية (الدوائر المغلقة) إلى نموذج مستقل 2 مجموعات من بين المواقع (أرجواني متقطع) ونموذج 2 - موقع متسلسل (الأزرق الصلبة). نموذج 2 - موقع sequentional يعطي بوضوح اتفاق شامل على نحو أفضل. كانت التركيزات المستخدمة A) 6 ميكرومتر ، 0.25 ملم ، B) 12 ميكرومتر ، 0.25 ملم ، C) 24 ميكرومتر ، و 0.5 مم ، D) 48 ميكرومتر ، 1.0 مم ، E) 96 ميكرومتر ، 1.9 ملم ، وواو) 196 ميكرومتر ، 3.86 ملم ، لAAC (6 &#39;) - II وAcCoA على التوالي.

<ol>
	<li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li><li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2004:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li><li>Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li><li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li><li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+(Danio+rerio)+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule.">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li><li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC.">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li><li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6'-N-acetyltransferase:+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold.">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li><li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC(6')-Ii+from+Enterococcus+faecium:+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity.">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li><li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6'-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium.">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li><li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ITC Data Analysis in Origin. , (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لقد كان هذا الجزء التحليلي من متغير ج تركيب سبق وصفها بالتفصيل 10. نحن هنا التقرير الجوانب العملية لجمع قواعد البيانات متغيرة ج مناسبة لهذا النهج. فمن الضروري أن يتم سحب جميع البروتين وعينات من يجند حلول بنفس الرصيد. ولذلك فمن المهم أن يتم تحضير محلول المخزون كاف...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetyl coenzyme A (AcCoA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>7365-45-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>431788</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectra/Por 2 Dialysis Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectrum Labs</td>
<td>132678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Syringe Filter (0.2 &mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>281445-477</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 &mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>7184-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>VP-ITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroCal</td>
<td>VP-ITC</td>
<td>Microcalorimeter used for measurements</td>
</tr>
<tr>
<td>ThermoVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroCal</td>
<td>USB Thermo Vac</td>
<td>Temperature Controlled Degassing Station</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

collecting variable-concentration isothermal titration calorimetry datasets in order to determine binding mechanisms

ويشيع استخدام قياس الكالوري المعايرة متحاور (ITC) لتحديد معالم الحرارية المرتبطة ملزمة ليجند لجزيء المضيف. مركز التجارة الدولية لديها بعض المزايا على نهج مشترك لدراسة الطيفية المضيف / يجند التفاعلات. على سبيل المثال ، يتم قياس الحرارة بشكل مباشر أو امتصاصها سراح عنصرين عندما تتفاعل و لا يتطلب أي صحفيين الخارجية. وبالتالي يتم الحصول عليها بشكل مباشر على السخانة ملزمة وثابتة الجمعيات (كا) من بيانات مركز التجارة الدولية ، ويمكن استخدامها لحساب مساهمة التدهور الحتمي. علاوة على ذلك ، شكل الأيسوثرم يعتمد على القيمة ج الآلي ونموذج المشاركة. يتم تعريف القيمة ك ج ج = ن [ف] TKA ، حيث [ف] t هي تركيز البروتين ، و n هو عدد من المواقع داخل ملزم يجند المضيف. في كثير من الحالات ، ومواقع متعددة لملزم يجند المعطاة هي غير متكافئة ومركز التجارة الدولية تسمح للتوصيف المعلمات ملزم الحرارية لموقع ملزمة لكل فرد. لكن هذا يتطلب أن يتم استخدام النموذج الصحيح ملزمة. هذا الخيار يمكن أن يكون مشكلة إذا كان يمكن احتواء نماذج مختلفة على نفس البيانات التجريبية. لقد أظهرنا سابقا أن هذه المشكلة يمكن التحايل عليها إجراء التجارب في العديد من القيم ، ج. وتناسب الأيسوثرم متعددة حصلت في مختلف ج قيم في نفس الوقت إلى نماذج منفصلة. يتم تعريف النموذج الصحيح المقبلة على أساس من التوافق الخير عبر ورقة العمل متغيرة ج بأكمله. يتم تطبيق هذه العملية هنا إلى أمينوغليكوزيد المقاومة المسببة للأمينوغليكوزيد انزيم - N - 6&#39; أسيتيل - II (AAC (6 &#39;) - II). على الرغم من أن لدينا منهجية تنطبق على أي نظام ، ويتجلى على نحو أفضل ضرورة هذه الاستراتيجية مع نظام جزيء ، أو يجند تظهر allostery cooperativity ، وعندما تقدم نماذج مختلفة تناسب ملزمة أساسا مطابقة لنفس البيانات. على حد علمنا ، لا توجد مثل هذه النظم المتاحة تجاريا. الجميح للسيارات (6 &#39;) ، الجزء الثاني ، هو هومو ديمر تحتوي على موقعين النشطة ، والتي تبين cooperativity بين مفارز اثنين. ومع ذلك ، يمكن الحصول على بيانات مركز التجارة الدولية في واحدة من طراز C - قيمة يكون لائقا أيضا بالتساوي على اثنين على الاقل من نماذج مختلفة نموذجا اثنين من مجموعات من مواقع مستقلة وثنائية موقع متسلسل النموذج (التعاونية). ج من خلال متفاوتة القيمة كما هو موضح أعلاه ، ثبت أن النموذج الصحيح ملزمة لالجميح للسيارات (6 &#39;) ، الثاني هو نموذج ثنائي موقع ملزمة متسلسلة. هنا ، نحن تصف الخطوات التي يجب اتخاذها عند إجراء التجارب في مركز التجارة الدولية من أجل الحصول على مجموعات البيانات المناسبة للمتغير ج التحليلات.

Watch this Scientific Journal Video about Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms at JoVE.com

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

مركز التجارة الدولية هو أداة قوية لدراسة الربط من يجند لمضيفه. في الأنظمة المعقدة ومع ذلك ، قد عدة نماذج تتناسب مع البيانات بشكل جيد على قدم المساواة. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتوضيح النموذج المناسب ملزمة للنظم المعقدة واستخراج المعلمات الحرارية المقابلة.

جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

collecting-variable-concentration-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  McGill University. مركز التجارة الدولية هو أداة قوية لدراسة الربط من يجند لمضيفه. في الأنظمة المعقدة ومع ذلك ، قد عدة نماذج تتناسب مع البيانات بشكل جيد على قدم المساواة. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتوضيح النموذج المناسب ملزمة للنظم المعقدة واستخراج المعلمات الحرارية المقابل...

Video: Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

معايرة Coronaviruses الإنسان باستخدام الفحص Immunoperoxidase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds 

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.
This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1&beta;, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNF&alpha;, INF&gamma;, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1&beta;, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds

A technique to collect and measure surgical wound biochemical mediators at specific time points.

جمع وقياس وسطاء Nociceptive والتهاب في الجروح الجراحية

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

متساوي الكالوري المعايرة لقياس جزيء ضخم - يجند الانجذاب

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP binds to vasopressin V2 receptors (V2R) on the surface of the cells and thereby induces synthesis of cAMP. This stimulates cellular signaling processes leading to changes in the phosphorylation of the water channel aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 and thereby triggers the translocation of AQP2 from intracellular vesicles into the plasma membrane facilitating water reabsorption from primary urine. Aberrations of AVP release from the pituitary or AVP-activated signaling in principal cells can cause central or nephrogenic diabetes insipidus, respectively; an elevated blood plasma AVP level is associated with cardiovascular diseases such as chronic heart failure and the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion.
Here, we present a protocol for cultivation of primary rat inner medullary collecting duct (IMCD) cells, which express V2R and AQP2 endogenously. The cells are suitable for elucidating molecular mechanisms underlying the control of AQP2 and thus to discover novel drug targets for the treatment of diseases associated with dysregulation of AVP-mediated water reabsorption. IMCD cells are obtained from rat renal inner medullae and are used for experiments six to eight days after seeding. IMCD cells can be cultured in regular cell culture dishes, flasks and micro-titer plates of different formats, the procedure only requires a few hours, and is appropriate for standard cell culture laboratories.

Arginine-vasopressin (AVP) controls fine-tuning of body water homeostasis through facilitating water reabsorption by renal principal cells. Here, we present a protocol for the cultivation of primary rat inner medullary collecting duct cells suitable for the elucidation of molecular mechanisms underlying AVP-mediated water reabsorption.

زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is achieved by reverse transcription of the RNA of interest using specific fluorescently labeled primers and subsequent analysis of the resulting cDNA fragments by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Simultaneously, a traditional Sanger sequencing reaction is run on the gel to map the ends of the cDNA fragments to their exact corresponding bases. In contrast to 5&#39;-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), where the product must be cloned and multiple candidates sequenced, the bulk of cDNA fragments generated by primer extension can be simultaneously detected in one gel run. In addition, the whole procedure (from reverse transcription to final analysis of the results) can be completed in one working day. By using fluorescently labeled primers, the use of hazardous radioactive isotope labeled reagents can be avoided and processing times are reduced as products can be detected during the electrophoresis procedure.
In the following protocol, we describe an in vivo fluorescent primer extension method to reliably and rapidly detect the 5&#39; ends of RNAs to deduce transcriptional starting points and RNA processing sites (e.g., by toxin-antitoxin system components) in S. aureus, E. coli and other bacteria.

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

مضان استنادا تمديد التمهيدي تقنية لتحديد ما الترانسكربتي المنطلقات ومواقع الشق من RNases<em&gt; في فيفو</em

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.