استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

يحصل الرحلان الحراري المجهري المسمى على ثوابت الانفصال ، أو KDs ، من التفاعلات الكيميائية الحيوية المتنوعة بكفاءة. يعطي هذا البروتوكول والفيديو المصاحب التقارب التقريبي ل Vam7 ، وهو بروتين SNARE الوحيد القابل للذوبان في الخميرة ، إلى حمض الفوسفاتيديك. هذه هي الطريقة التي يرتبط بها Vam7 بغشاءين قبل التفاعل مع البروتينات الأخرى.

تحصل هذه الطريقة على KDs بسرعة للتفاعلات الكيميائية الحيوية المتنوعة بتكلفة منخفضة ، مع قابلية عالية للتكرار وبأقل تكلفة للبروتين. هذه التقنية مناسبة للمرحلة الأولى من التطوير الصيدلاني ، مما يسمح بالحصول على KDs بسهولة لتحديد مركبات الرصاص المحتملة. قبل البدء في التحليل ، قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من جهاز MST وافتح برنامج التحكم.

تأكد من توصيل الكمبيوتر بالجهاز وفي حالة الاتصال وقم بتعيين MST قبل 3 ثوان ، و MST إلى 30 ثانية ، و Fluorescence Recovery إلى بعد 1 ثانية. لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الرباط المستهدف، واسم تحليل الليكاند، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز معايرة بالتحليل الحجمي باستخدام نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي للتعبئة التلقائية. حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيما لكل طاقة لاختبار أقوى ملاءمة للربط.

لإعداد عينات MST المصنفة ، قم بتخفيف محلول Vam7-octahistidine إلى تركيز 200 نانومولار وصبغة NTA-Atto 647 إلى تركيز 100 نانومولار ، كلاهما في PBS. امزج Vam7-octahistidine وصبغة NTA-Atto 647 بنسبة حجمية 1: 1 واسمح للخليط بالجلوس في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخليط الصبغة والبروتين وتخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى بضع ساعات قبل الاستخدام.

ثم ، قم بإعداد العينة ، وخذ الرباط المصبوغ وفضح التحليل. بالنسبة للرحلان الحراري المجهري للعينة ، افتح الجهاز وحرك الرف الشعري للخارج. قم بتحميل الشعيرات الدموية للعينة في الحامل بأعلى تركيز في الموضع الأول وحدد القناة الحمراء في برنامج التحكم.

ثم قم بتحميل الرف في الجهاز. ثم حدد نطاقا من طاقة MST وابدأ قياس MST لمسح Cap Scan وقم بتقييم استجابة التحول. تظهر هنا آثار ثيرموفيرتيك من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومول مقابل 50 نانومولار NTA-Atto 647 المسمى مجال Vam7.

يمكن ملاحظة التألق الأولي ، والقفز الزمني ، والرحلان الحراري ، مما يسمح بحساب KD من أي واحد أو مجموعة من هذه القياسات. يمكن رسم منحنى التشبع من هذه النتائج ، على سبيل المثال ، للرحلان الحراري مع إخراج قفزة الوقت ، كما هو موضح في الرسم البياني. بشكل عام ، يتم تحديد نتائج MST باستخدام مقياس السجل ، مع مراعاة تركيز البروتين لتحديد تقارب الارتباط عن طريق اختيار نموذج KD وإدخال تركيز البروتين.

عند تنفيذ هذا البروتوكول ، تأكد من أن المحلول في وسط الشعيرات الدموية وأنه لا توجد فقاعات هواء وأن الشعيرات الدموية لا تحتوي على غبار أو محلول على السطح الخارجي للشعيرات الدموية. يمكن استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة أو رنين البلازمون السطحي للتحقق من صحة الدينار الكويتي التجريبي الذي تم الحصول عليه. وإذا كان هناك ربط تعاوني محتمل، فإن مركز التجارة الدولية سيكون الطريقة المنطقية التالية التي يتم تنفيذها، بالنظر إلى الموارد.

وقد مكنت هذه التقنية الباحثين التقليديين في علم الأحياء من دمج تقنيات الفحص البيوفيزيائي في أبحاثهم لتحديد علاقات المسار. أحد الأمثلة على هذه التقنية هو الليزيز الخلوي مع البروتين المستهدف المعبر عنه داخليا ، حيث تعد علامة GFP طريقة جديدة لإجراء فحص تقليدي منسدل.