עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הקנדי מחקר (CIHR), הלאומית למדע וההנדסה מועצת המחקר (NSERC), וכן להעניק הכשרה CIHR מלגה (אל LF). אנו מודים פרופ &#39;ג&#39;רארד ד רייט (אוניברסיטת מקמאסטר, קנדה) עבור AAC (6) II-פלסמיד ביטוי.

1. הכנת פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מקרומולקולה של עניין. (במקרה זה, aminoglycoside N-6&#39;-acetyltransferase-II (AAC6&#39;-II), מבודד כפי שדווח במקום אחר. 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 ליטרים של חיץ דיאליזה. (במקרה זה השתמשנו 25 מ&quot;מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, MW 238.3 g / mol), המכיל חומצה 2 mM ethylenediaminetetraacetic (EDTA, MW 292.2), ב-pH 7.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze החלבון המדגם (6 &#39;) II-AAC (5 מ&quot;ל ב 400 מיקרומטר) המשמש חייב להיות dialyzed במאגר דיאליזה (3 x 1.3 ל&#39;). הפתרון הסופי דיאליזה נשמר לשטוף את המכונה לדלל דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון הסופי דיאליזה דרך מסנן תאית 0.45 מיקרומטר, ומאוחסנים ב 4 ° C. יהיה המכונה &quot;חיץ ריצה&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון פתרון סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק אשר כבר השטיפה עם חיץ פועל. מדדו את הריכוז הסופי של החלבון באמצעות assay סטנדרטי (ברדפורד, לאורי, וכו &#39;) או ספיגת UV. אחסן את החלבון על מנת למקסם את יציבות לטווח ארוך. (במקרה של AAC (6 &#39;)-II, משמעות הדבר היא אחסון ב 4 ° C. AAC (6&#39;)-II אינו שומר פעילות לאחר מקפיא הפשרה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200μL של פתרון 25 מ&quot;מ מניות של אצטיל קואנזים A (AcCoA, ליגנד, MW 809.57) על ידי המסת 4.0 מ&quot;ג פועל חיץ. להקפיא ב -78 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל חלבון דגימות ליגנד חייב מקורן הפתרונות מניות זהה, כדי למזער מדגם אקראי ל-מדגם התנודות בריכוז. גורם תיקון יחיד עבור ריכוז החלבון על פני כולו משתנה ג במערך מותאם בניתוח. 10 </li></ol> 2. המרכז לטניס בישראל דגימות הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התמיסה אנזים לערך-c של 64 עם נפח סופי של 2 מ&quot;ל. (במקרה של AAC (6 &#39;)-II, הדבר מקביל ל 192 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ההפשרה (AcCoA) ליגנד מניות פתרון במי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5 מ&quot;ל של פתרון AcCoA 10 פעמים יותר מרוכז ואז את מספר אתרי הקישור על החלבון, במקרה זה 4 מ&quot;מ, על ידי דילול של 80 μL פתרון המניות AcCoA ב 420 μL של הפעלת המאגר. העברת לתוך צינור טפטפת מילוי. לחזור במהירות את הפתרון מניות AcCoA ל -78 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה החלבון ופתרונות תחת ואקום עבור 5 דקות בטמפרטורה של 1 ° C מתחת לטמפרטורת הריצה הרצוי (19 ° C). </li></ol> 3. הגדרת את המזרק 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המזרק הזרקה באמצעות מזרק בעל עד מהדק מזרק מראש רכוב הוא באותו גובה כמו בעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את מהדק המזרק השני על המזרק להזרקת עד נלחץ בנחישות נגד בתחתית מחזיק את המזרק. בעדינות להדק את מהדק עם סיפק 0.050 &quot;דרייב פוינט Ball Hex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחזיק מזרק לתוך מחזיק פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק בעדינות את פיפטה מזרק לתוך מזרק את הזריקה. ודא את קצה הבוכנה מוזן ישירות לתוך החור של המזרק. לאחר מוכנס באופן מלא, לדפוק את הצווארון נעילה של בעל מזרק לתוך מזרק פיפטה. </li></ol> 4. טוען התא מדגם 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תא דגימה עם מינימום של 50 מ&quot;ל של ריצה חיץ, ולהסיר כל נוזל הנותרים באמצעות ארוכי מחט מזרק זכוכית 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט למשוך מינימום של 1.8 מ&quot;ל של תמיסת חלבון מדגם לתוך מזרק נקי ויבש 2.5 ארוכי מחט מ&quot;ל. היזהר שלא להציג את כל הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס מחט בתא מדגם ולגעת בעדינות את החלק התחתון של התא. הרם מעט קצה (~ 1 מ&quot;מ) בעדינות להזריק AAC (6 &#39;)-II פתרון לתוך התא עד נוזל עודף גלוי מעל החלק העליון של התא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להעלות את המחט על 1 ס&quot;מ תוך הבטחת נשאר נוזלי הצפת. מהר לסגת להזריק כמות קטנה של פתרון (~ 0.25 מ&quot;ל) כדי להסיר כל הבועות לכוד בתא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל העודפים פתרון. זו מושגת על ידי מחליק בעדינות את המחט בצד של גלישה אל תוך התא המדגם. קצה המזרק יפגע אדן, זהו גובה השאיפה לפתרון פועל. הסר את כל נוזל אשר יושב מעל קו זה. </li></ol> 5. טוען מזרק זריקה וייזום לרוץ 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מזרק פלסטיק טעינת צינור ליציאת למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבוכנה בקצה התחתון לחלק העליון של הנמל למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון AcCoA בצינור טפטפת מילוי בחלק התחתון של בעל פיפטה. קצה המזרק לא צריך לגעת בתחתית צינור המילוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט למשוך את הפתרון לתוך המזרק עד כמות קטנה נכנס הצינור של מזרק הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את יציאת למלא על ידי הפחתת קצה הבוכנה ולחץ על כפתור נמל סגור את מילוי. טהר ולמלא, על ידי לחיצה על כפתור הטיהור-&gt; דיו, 3 פעמים כדי להסיר בועות אוויר שאולי להילכד במהלך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור מילוי מבעל פיפטה ו לנגב בעדינות את קצה המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח הרכבה פיפטה ו מזרק בעדינות נמוך לתוך התא המדגם. המשך לאט כמו המזרק יכול בקלות לכופף, ולכן יש צורך בזהירות רבה. ודא את המזרק מוכנס כהלכה על ידי לחיצה על הבסיס של נעילה צווארון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הטמפרטורה הרצויה פועל (במקרה זה 20 ° C), ובחר כוח התייחסות כי הוא מעט גדול יותר זרימת החום המרבי הזרקת הצפוי (ב 20μcal/sec במקרה זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית הזרקת כמויות הרצוי ועיכובים. (במקרה זה, 28 זריקות הועסקו. הזריקה הראשונה בהיקף של 2 μL עם עיכוב של 60. זריקות כל הבאים היו כרכים של μL 10 עם עיכובים של 330.) </li></ol> 6. לאחר הפעלת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסך הכל מפעילה הבאים לחזור על שלבים 2-5, תוך הפחתת AAC (6 &#39;) ו-II ריכוזי AcCoA בפקטור של 2,4,8,16, ו 32. </li></ol> 7. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הליך ראוי אשר מתאים לכל גלובלי של איזותרמות כדי להגדיר אחד הפרמטרים מחייב, כפי שתואר לעיל 10. </li></ol> 8. נציג תוצאות נציג נתונים מוצגים באיור 1. הצורות של איזותרמות אמור להשתנות עם ריכוז. מעברים חדים צפויים יותר עבור c-ערכים (כלומר חלבון גבוהה ריכוזי ליגנד) (איור 2). במקרה של AAC (6 &#39;)-II, הדגם שני רציפים האתר נותן בכושר טוב יותר מאשר אחד מתאר שתי מערכות, אתרי זהות עצמאית עם stoichiometries מתכווננת. <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. איזותרמות המיוצר על ידי טיטרציה של AcCoA (3.86 mM) לתוך AAC (6 &#39;)-II (192 מיקרומטר). א) זכר גלם המרכז לטניס בישראל. ב) ערכים משולבים המשמשים לקביעת פרמטרים מחייבים (ריבועים) עם בהתקף 2-אתר רציפים (-). <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור איזותרמות המרכז לטניס בישראל עבור AcCoA טיטרציה לתוך AAC (6 &#39;)-II בריכוזים שונים. נתוני הניסוי (עיגולים פתוח) היו לנכון מודל עצמאי 2 סטים של אתרי (מג&#39;נטה מקווקו) לבין מודל 2-אתר רציפים (כחול מוצק). מודל 2-אתר sequentional בבירור נותן הסכמה כללית טובה יותר. הריכוזים היו מועסקים) 6 מיקרומטר, 0.25 מ&quot;מ, B) 12 מיקרומטר, 0.25 מ&quot;מ, ג) 24 מיקרומטר, 0.5 מ&quot;מ, ד) 48 מיקרומטר, 1.0 מ&quot;מ, E) 96 מיקרומטר, 1.9 מ&quot;מ, ו-F) 196 מיקרומטר, 3.86 מ&quot;מ, עבור AAC (6 &#39;) ו-II AcCoA בהתאמה.

<ol>
	<li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li><li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2004:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li><li>Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li><li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li><li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+(Danio+rerio)+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule.">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li><li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC.">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li><li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6'-N-acetyltransferase:+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold.">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li><li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC(6')-Ii+from+Enterococcus+faecium:+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity.">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li><li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6'-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium.">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li><li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ITC Data Analysis in Origin. , (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חלק זה של הניתוח משתנה-c הולם תוארה בעבר בהרחבה 10. כאן אנו מדווחים על ההיבטים המעשיים של איסוף משתנה ג מערכי נתונים מתאים לגישה זו. זה חיוני כי כל חלבון דגימות ליגנד לקוחים הפתרונות מניות זהה. לכן חשוב כי המניה מספקת פתרון מוכן בתחילה כדי להשלים את הסדרה כולה של נ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetyl coenzyme A (AcCoA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>7365-45-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>431788</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectra/Por 2 Dialysis Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectrum Labs</td>
<td>132678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Syringe Filter (0.2 &mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>281445-477</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 &mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>7184-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>VP-ITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroCal</td>
<td>VP-ITC</td>
<td>Microcalorimeter used for measurements</td>
</tr>
<tr>
<td>ThermoVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroCal</td>
<td>USB Thermo Vac</td>
<td>Temperature Controlled Degassing Station</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

collecting variable-concentration isothermal titration calorimetry datasets in order to determine binding mechanisms

Calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי (ITC) משמש בדרך כלל כדי לקבוע פרמטרים תרמודינמיים הקשורים מחייב של ליגנד כדי מקרומולקולה המארח. המרכז לטניס בישראל יש כמה יתרונות על פני הגישות ספקטרוסקופיות משותף לחקר המארח / אינטראקציות ליגנד. לדוגמה, החום שוחררו או נספג כאשר שני המרכיבים אינטראקציה נמדדת ישירות ואינו דורש כל הכתבים אקסוגניים. לפיכך אנתלפיה מחייב את העמותה קבוע (קה) מתקבלים נתונים ישירות מן המרכז לטניס בישראל, והוא יכול לשמש כדי לחשב את התרומה entropic. יתר על כן, את הצורה של האיזותרמה תלויה ערך-c לבין מודל מכניסטית מעורב. C-ערך מוגדר c = n [טז] tKa, שם [טז] לא הוא ריכוז חלבון, n הוא מספר אתרי קשירה ליגנד בתוך הפונדקאי. במקרים רבים, אתרי הקישור מרובים עבור ליגנד מסוים הם לא שוות ערך המרכז לטניס בישראל מאפשר אפיון של פרמטרים תרמודינמיים מחייב עבור כל אתר קשירה יחיד. אולם זה דורש כי המודל מחייב נכונה לשמש. בחירה זו יכולה להיות בעייתית אם דגמים שונים יכולים להתאים את נתוני הניסוי אותו. הראינו בעבר כי בעיה זו ניתן לעקוף על ידי ביצוע ניסויים בכמה c-ערכים. איזותרמות מספר המתקבל שונה c-ערכים ראויים בו זמנית מודלים נפרדים. המודל הנכון הוא זיהה הבא מבוסס על בטוב להתאים לרוחב במערך את המשתנה-c כולו. תהליך זה מיושם כאן כדי aminoglycoside התנגדות גורמי aminoglycoside האנזים N-6&#39;-acetyltransferase-II (AAC (6 &#39;)-II). אף על פי המתודולוגיה שלנו הוא ישים לכל מערכת, הצורך של אסטרטגיה זו באה לידי ביטוי טוב יותר עם מערכת מקרומולקולה-ליגנד המראה allostery או cooperativity, וכאשר מודלים שונים מחייב לספק מתאים זהה במהותו אל אותם נתונים. למיטב ידיעתנו, אין מערכות כאלה זמינים מסחרית. AAC (6 &#39;)-II, הוא הומו-דימר המכיל שני אתרים פעילים, מראה cooperativity בין שתי יחידות משנה. עם זאת נתוני המרכז לטניס בישראל להשיג בחנות אחת c-ערך יכול להיות מתאים באותה מידה לפחות שני דגמים שונים מודל עצמאי של שני סטים של אתרי וכן שני רציפים באתר (שיתופית) מודל. באמצעות שינוי c-ערך כפי שהוסבר לעיל, נקבע כי המודל הנכון עבור מחייב AAC (6 &#39;)-II הוא מודל דו אתר הקישור רציפים. בזאת, אנו מתארים את הצעדים שיש לנקוט בעת ביצוע ניסויים המרכז לטניס בישראל על מנת לקבל ערכות נתונים מתאים משתנה ג ומנתחת.

Watch this Scientific Journal Video about Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms at JoVE.com

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

collecting-variable-concentration-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  McGill University. המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.

Video: Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds 

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.
This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1&beta;, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNF&alpha;, INF&gamma;, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1&beta;, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds

A technique to collect and measure surgical wound biochemical mediators at specific time points.

איסוף מדידת מגשרים nociceptive ועל פצעים דלקתיים כירורגי

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP binds to vasopressin V2 receptors (V2R) on the surface of the cells and thereby induces synthesis of cAMP. This stimulates cellular signaling processes leading to changes in the phosphorylation of the water channel aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 and thereby triggers the translocation of AQP2 from intracellular vesicles into the plasma membrane facilitating water reabsorption from primary urine. Aberrations of AVP release from the pituitary or AVP-activated signaling in principal cells can cause central or nephrogenic diabetes insipidus, respectively; an elevated blood plasma AVP level is associated with cardiovascular diseases such as chronic heart failure and the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion.
Here, we present a protocol for cultivation of primary rat inner medullary collecting duct (IMCD) cells, which express V2R and AQP2 endogenously. The cells are suitable for elucidating molecular mechanisms underlying the control of AQP2 and thus to discover novel drug targets for the treatment of diseases associated with dysregulation of AVP-mediated water reabsorption. IMCD cells are obtained from rat renal inner medullae and are used for experiments six to eight days after seeding. IMCD cells can be cultured in regular cell culture dishes, flasks and micro-titer plates of different formats, the procedure only requires a few hours, and is appropriate for standard cell culture laboratories.

Arginine-vasopressin (AVP) controls fine-tuning of body water homeostasis through facilitating water reabsorption by renal principal cells. Here, we present a protocol for the cultivation of primary rat inner medullary collecting duct cells suitable for the elucidation of molecular mechanisms underlying AVP-mediated water reabsorption.

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is achieved by reverse transcription of the RNA of interest using specific fluorescently labeled primers and subsequent analysis of the resulting cDNA fragments by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Simultaneously, a traditional Sanger sequencing reaction is run on the gel to map the ends of the cDNA fragments to their exact corresponding bases. In contrast to 5&#39;-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), where the product must be cloned and multiple candidates sequenced, the bulk of cDNA fragments generated by primer extension can be simultaneously detected in one gel run. In addition, the whole procedure (from reverse transcription to final analysis of the results) can be completed in one working day. By using fluorescently labeled primers, the use of hazardous radioactive isotope labeled reagents can be avoided and processing times are reduced as products can be detected during the electrophoresis procedure.
In the following protocol, we describe an in vivo fluorescent primer extension method to reliably and rapidly detect the 5&#39; ends of RNAs to deduce transcriptional starting points and RNA processing sites (e.g., by toxin-antitoxin system components) in S. aureus, E. coli and other bacteria.

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases<em&gt; In vivo</em

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.